北大湯富酬團(tuán)隊：發(fā)表單細(xì)胞表觀多組學(xué)測序技術(shù)（single-cell COOL-seq）成果

一個細(xì)胞完成5個組學(xué)層面的測定，這種方法你知道嗎？

現(xiàn)有的基于高通量測序來分析全基因組染色質(zhì)狀態(tài)的研究方法通常需要大量細(xì)胞，并且難以在單細(xì)胞分辨率上對多種組學(xué)之間的互動關(guān)系進(jìn)行研究。2017年6月16日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物動態(tài)光學(xué)成像中心湯富酬課題組在上發(fā)展了對一個單細(xì)胞同時進(jìn)行染色質(zhì)狀態(tài)、DNA甲基化、基因組拷貝數(shù)變異、以及染色體倍性的全基因組測序技術(shù)（single-cell COOL-seq），并采用這一技術(shù)在單細(xì)胞分辨率上系統(tǒng)、深入地解析了小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中表觀基因組重編程的關(guān)鍵特征，以及染色質(zhì)狀態(tài)與DNA甲基化之間的互動關(guān)系，并在《Cell Research》雜志上在線發(fā)表了題為“Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells”的研究論文。

論文解讀：

現(xiàn)有的基于高通量測序來分析全基因組染色質(zhì)狀態(tài)的研究方法通常需要大量細(xì)胞（例如ATAC-seq、DNase-seq、FAIRE-seq、MNase-seq等）。即使這些方法可以做到單細(xì)胞分辨率，也無法對同一個單細(xì)胞的各個表觀基因組層面同時進(jìn)行分析，因而無法在單細(xì)胞分辨率上對多種組學(xué)之間的互動關(guān)系進(jìn)行研究。

湯富酬課題組將NOMe-seq（全基因組核小體定位及DNA甲基化組測序）技術(shù)和PBAT-seq技術(shù)（全基因組重亞硫酸鹽測序）巧妙地結(jié)合起來（圖1），并進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化和提高，實現(xiàn)了對同一個單細(xì)胞進(jìn)行多達(dá)5個層面（染色質(zhì)狀態(tài)、核小體定位、DNA甲基化、基因組拷貝數(shù)變異和染色體倍性）的基因組和表觀基因組特征的分析。

圖1: single-cell COOL-seq原理圖

技術(shù)優(yōu)點：

scCOOL-seq技術(shù)除了可以在單細(xì)胞水平上同時對多種組學(xué)進(jìn)行分析，與現(xiàn)有的分析染色質(zhì)狀態(tài)的單細(xì)胞測序技術(shù)相比，scCOOL-seq技術(shù)還具有如下優(yōu)點：

（1）對于基因組中核心的功能元件區(qū)域具有很高的靈敏度和覆蓋度。例如，對于小鼠胚胎干細(xì)胞系的一個單細(xì)胞，可以同時檢測到18,000多個基因（所有已知基因的75%）的啟動子區(qū)域的染色質(zhì)狀態(tài)以及DNA甲基化水平, 也可以同時檢測到11,000多個CpG島（所有已知CpG島的70%）的染色質(zhì)狀態(tài)以及DNA甲基化水平；這為分析干細(xì)胞分化發(fā)育過程中染色質(zhì)狀態(tài)的異質(zhì)性以及DNA甲基化水平的異質(zhì)性提供了強(qiáng)大的工具。

（2）可以地鑒定出染色質(zhì)的開放狀態(tài)和關(guān)閉狀態(tài)，準(zhǔn)確地把染色質(zhì)關(guān)閉狀態(tài)與由于技術(shù)原因未檢測到的情況（假陰性）區(qū)分開來。現(xiàn)有的其他單細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)測序技術(shù)（例如scATAC-seq和scDNase-seq技術(shù)）無法將染色質(zhì)關(guān)閉狀態(tài)和未檢測到的情況（假陰性）區(qū)分開，這一缺點在現(xiàn)有技術(shù)的靈敏度比較低的情況下尤為嚴(yán)重。而scCOOL-seq技術(shù)可以準(zhǔn)確地區(qū)分染色質(zhì)關(guān)閉狀態(tài)（檢測到了該基因組DNA片段，但是其中的GpC位點沒有被甲基化）和由于技術(shù)原因未檢測到的情況（沒有檢測到該基因組DNA片段）。這樣對一種細(xì)胞類型中不同的單個細(xì)胞之間同一個基因組區(qū)域的染色質(zhì)開放狀態(tài)和關(guān)閉狀態(tài)之間的比例可以給出的測量結(jié)果，而不受檢測靈敏度波動的影響。

（3）可以對同一個DNA單分子同時獲得其染色質(zhì)狀態(tài)和DNA甲基化的信息，使得這一技術(shù)不但具有單細(xì)胞分辨率，甚至達(dá)到了單分子分辨率，可以對同一個二倍體細(xì)胞的兩個等位基因分別進(jìn)行染色質(zhì)狀態(tài)和DNA甲基化的分析。

（4）由于該方法同時擴(kuò)增和測序開放的和關(guān)閉的染色質(zhì)區(qū)域，因而不受細(xì)胞中線粒體DNA含量波動的影響。在細(xì)胞中線粒體DNA通常是環(huán)形裸露的DNA，一般處于開放狀態(tài)。現(xiàn)有的其他單細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)測序技術(shù)（例如scATAC-seq和scDNase-seq技術(shù)）由于只擴(kuò)增和測序開放的染色質(zhì)區(qū)域，因而極大地受細(xì)胞中線粒體DNA含量的影響，特別是在著床前的早期胚胎細(xì)胞中線粒體DNA的含量是普通細(xì)胞的數(shù)十倍甚至數(shù)百倍，因而對于scATAC-seq和scDNase-seq等技術(shù)造成嚴(yán)重影響。而scCOOL-seq技術(shù)由于同時擴(kuò)增和測序開放的和關(guān)閉的染色質(zhì)區(qū)域而不受這一問題的影響。

（5）由于摻入了10% - 20%的外源lambda DNA，所以可以準(zhǔn)確判斷所分析單個細(xì)胞所處的細(xì)胞周期階段以及染色體倍性。這對于準(zhǔn)確分析染色質(zhì)狀態(tài)和DNA甲基化與細(xì)胞周期以及染色體倍性的關(guān)系非常有幫助。

考慮到多組學(xué)的信息量、有效數(shù)據(jù)量帶來的高昂測序成本等問題，對于細(xì)胞數(shù)量少，異質(zhì)性強(qiáng)的著床前胚胎發(fā)育過程的研究，scCOOL-seq方法非常適合。該方法可以更好地覆蓋全基因組，有效地解決了目前scATAC-seq研究中線粒體片段過度富集導(dǎo)致的有效數(shù)據(jù)量過少的問題。同時，該方法可以同時分析單個細(xì)胞中染色質(zhì)開放程度、核小體定位、DNA甲基化、基因組拷貝數(shù)變異、以及染色體倍性這5個組學(xué)層面，對于難以大量獲得的哺乳動物早期胚胎的發(fā)育、以及復(fù)雜的癌癥等疾病研究，都將提供全面有效的解決方案。

實例應(yīng)用：

該課題組利用這一新建立的scCOOL-seq方法，在單細(xì)胞分辨率系統(tǒng)地描繪了小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中表觀基因組多個層面的動態(tài)變化。高度特化的精子和卵細(xì)胞結(jié)合后，會進(jìn)行一系列復(fù)雜、的染色質(zhì)重塑過程，從而建立起早期胚胎發(fā)育的性和多能性。對該過程的解析將有利于人們理解細(xì)胞多能性建立過程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制以及胚胎發(fā)育異常的分子機(jī)理，該項研究發(fā)現(xiàn)：

（1）受精后12小時以內(nèi)，來自高度特化的卵細(xì)胞和精子的雌雄原核就經(jīng)歷了大規(guī)模的基因組去甲基化，父源基因組DNA甲基化程度從精子中的80%（平均數(shù)）降低到雄原核中的38%（p=1.4×10-11）；同時母源基因組DNA甲基化程度從卵細(xì)胞中的32%降低到雌原核中的28%（p=6.3×10-5）。在此過程中，父母源基因組的染色體狀態(tài)迅速打開，在受精卵的原核期就已經(jīng)達(dá)到高度開放的狀態(tài)，隨后在受精卵晚期染色質(zhì)開放程度大幅度回落，并在2-細(xì)胞階段之后開放程度再次逐步增加，到囊胚期時達(dá)到zui高點（圖2）。

圖2：小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中基因組內(nèi)源DNA甲基化（A）與染色質(zhì)狀態(tài)（B）以及染色質(zhì)狀態(tài)異質(zhì)性（基因啟動子區(qū)域；Homogeneously open、Divergent、Homogeneously closed三種異質(zhì)性狀態(tài)）（C）（D）的動態(tài)變化

（2）在單細(xì)胞分辨率系統(tǒng)分析了小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)狀態(tài)的異質(zhì)性。根據(jù)每個基因啟動子區(qū)域在同一個發(fā)育階段不同單細(xì)胞之間染色質(zhì)狀態(tài)的異質(zhì)性，將小鼠的基因劃分成均勻開放（Homogeneously open）、開放/關(guān)閉混合態(tài)（Divergent）、均勻關(guān)閉（Homogeneously closed）這三種狀態(tài)。該研究發(fā)現(xiàn)在受精后12個小時以內(nèi)受精卵中大部分基因的啟動子區(qū)域就由均勻關(guān)閉狀態(tài)迅速重編程為均勻開放狀態(tài)，為合子基因在隨后的轉(zhuǎn)錄做好準(zhǔn)備（圖2）。

（3）通過RNA聚合酶抑制劑抑制轉(zhuǎn)錄的實驗，在單細(xì)胞分辨率證明持續(xù)轉(zhuǎn)錄對于維持基因啟動子區(qū)域的染色質(zhì)開放狀態(tài)具有重要作用。從受精前的卵細(xì)胞到受精后的晚期受精卵時期，啟動子區(qū)大片段染色質(zhì)開放區(qū)域（長度大于300bp）的數(shù)量大幅度增加。該研究發(fā)現(xiàn)，使用RNA聚合酶抑制劑α-Amanitin處理受精卵、抑制其轉(zhuǎn)錄活動，會導(dǎo)致數(shù)千個（56%）基因的啟動子區(qū)大片段染色質(zhì)開放區(qū)域重新關(guān)閉，說明持續(xù)的轉(zhuǎn)錄對于維持早期胚胎中大部分基因的啟動子處于開放狀態(tài)是必需的，染色質(zhì)狀態(tài)開放和轉(zhuǎn)錄活動互相促進(jìn)，共同維持合子基因的穩(wěn)定表達(dá)（圖3）。

圖3：轉(zhuǎn)錄對染色質(zhì)開放狀態(tài)的維持以及轉(zhuǎn)錄因子對染色質(zhì)開放區(qū)域的調(diào)控作用

（4）發(fā)現(xiàn)多能性核心因子Oct4的靶基因結(jié)合位點在4-細(xì)胞階段就已經(jīng)打開并處于開放狀態(tài)，遠(yuǎn)早于真正建立多能性的囊胚期，暗示這些位點作為潛在的順式調(diào)控元件可能參與了早期胚胎細(xì)胞的命運決定過程。

（5）在單個細(xì)胞內(nèi)對父母源基因組的染色質(zhì)狀態(tài)以及DNA甲基化進(jìn)行了深入分析。從受精卵晚期到4細(xì)胞胚胎時期，在基因間區(qū)（intergenic region）父源基因組甲基化要明顯高于母源基因組；而在基因區(qū)（gene body），父源基因組甲基化要顯著低于母源基因組。這是由于在基因間區(qū)，父源基因組的去甲基化速度較慢；而在基因區(qū)，父源基因組的去甲基化速度要遠(yuǎn)快于母源基因組的去甲基化速度。更重要的是，對于基因區(qū)，胚胎期表達(dá)水平越高的基因其父母源基因組DNA甲基化的不對稱性越強(qiáng)烈（表達(dá)水平越高，母源基因組甲基化就比父源基因組高越多）。與此相反，受精后父母源基因組的染色質(zhì)狀態(tài)就迅速同步打開，到受精后12小時，父母源基因組的染色質(zhì)狀態(tài)在每個單細(xì)胞中就已經(jīng)達(dá)到相同的開放狀態(tài)，并在整個植入前時期維持這一父母源基因組之間染色質(zhì)狀態(tài)的平衡。這說明受精后，染色質(zhì)狀態(tài)和DNA甲基化進(jìn)行了不同步的重編程過程，由于染色質(zhì)狀態(tài)對于合子基因的激活可能更重要，所以受精后父母源基因組的染色質(zhì)狀態(tài)快速重編程、在每個單細(xì)胞中迅速達(dá)到平衡并一直維持。而DNA甲基化的重編程要慢一些并在父母源基因組之間維持不對稱分布：在基因間區(qū)，父源基因組甲基化高于母源基因組；而在基因區(qū)，父源基因組甲基化低于母源基因組，并且與胚胎期基因表達(dá)水平相關(guān)（圖4）。

圖4：小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中父母源基因組DNA甲基化的不對稱分布

（6）在單細(xì)胞分辨率解析了雌性胚胎細(xì)胞中父母源X染色體的DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)重編程過程的異同。從配子到原核期受精卵，父源X染色體的DNA去甲基化速度明顯比常染色體慢，而母源X染色體的DNA去甲基化速度和常染色體相當(dāng)。從受精卵晚期到4細(xì)胞胚胎時期，父源X染色體的DNA甲基化明顯高于母源X染色體，直到囊胚期，父母源X染色體的DNA甲基化水平才達(dá)到一致。這說明受精之后，在雌性胚胎中失活的父源X染色體其DNA甲基化重編程速度要明顯慢于活躍的母源X染色體。二者之間DNA甲基化的差異一直到囊胚晚期才逐漸消除。受精后，雌性胚胎中父母源X染色體同步進(jìn)行快速的染色質(zhì)狀態(tài)重編程，并在整個植入前時期維持這一父母源X染色體之間染色質(zhì)狀態(tài)的平衡。（圖5）。

圖5：小鼠著床前雌性胚胎單個細(xì)胞中父母源X染色體的DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)的動態(tài)變化

（7）在單細(xì)胞分辨率揭示了小鼠植入前胚胎發(fā)育過程中表觀基因組的異質(zhì)性。受精后，基因組中大部分基因的啟動子區(qū)域在同一種細(xì)胞的不同單個細(xì)胞之間維持著均勻的DNA甲基化和均勻的染色質(zhì)開放狀態(tài)。部分基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化或染色質(zhì)狀態(tài)在同一個階段胚胎內(nèi)不同單個細(xì)胞之間具有強(qiáng)烈的異質(zhì)性。然而，啟動子區(qū)域DNA甲基化異質(zhì)性強(qiáng)烈的基因和染色質(zhì)狀態(tài)異質(zhì)性強(qiáng)烈的基因分別是兩類不同的基因。這暗示在小鼠著床前胚胎發(fā)育的過程中，染色質(zhì)狀態(tài)異質(zhì)性和DNA甲基化異質(zhì)性可能分別受不同機(jī)制的調(diào)控。

（8）在單細(xì)胞分辨率將細(xì)胞周期與染色質(zhì)狀態(tài)了起來。研究人員在每個單細(xì)胞文庫中加入了等量的lambda DNA，通過基因組測序讀數(shù)和lambda DNA測序讀數(shù)之間的比例準(zhǔn)確推斷出每個單細(xì)胞的倍性和細(xì)胞周期階段。該研究利用小鼠胚胎干細(xì)胞研究中已有的染色質(zhì)優(yōu)先復(fù)制和后續(xù)復(fù)制區(qū)域作為參照，發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域在小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中復(fù)制先后順序和胚胎干細(xì)胞中一致，說明小鼠著床前胚胎在體內(nèi)發(fā)育過程中和胚胎干細(xì)胞使用了基本相同的一組DNA復(fù)制起始位點。

圖6:小鼠著床前胚胎DNA甲基化和染色質(zhì)重塑特征示意圖

該研究在上開發(fā)了對同一個單細(xì)胞可以同時研究其染色質(zhì)狀態(tài)、核小體定位、DNA甲基化、基因組拷貝數(shù)變異、以及染色體倍性5個層面的單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)，并利用該技術(shù)對小鼠著床前胚胎發(fā)育的7個關(guān)鍵階段進(jìn)行了全基因組水平、單細(xì)胞分辨率、單堿基精度的表觀基因組研究，并深度解析了父母源基因組在著床前胚胎發(fā)育中DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)的重編程過程。該研究系統(tǒng)地描繪了高度特化的配子在受精后重編程到具有發(fā)育性的受精卵、以及進(jìn)一步發(fā)育成多能性胚胎的過程中， DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)發(fā)生的、有序的變化，以及各個組學(xué)層面之間的互動關(guān)系（圖6）。

該工作為今后人們繼續(xù)研究哺乳動物早期胚胎細(xì)胞性和多能性的開啟奠定了基礎(chǔ)，同時為體細(xì)胞克隆效率的提高以及早期胚胎發(fā)育異常的診斷與治療提供了新思路。

據(jù)悉，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院BIOPIC中心的博士后郭帆博士（現(xiàn)為四川大學(xué)研究員）、博士生李琳、李靜云為該論文的并列*作者；北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院湯富酬研究員和四川大學(xué)郭帆研究員為這篇文章的共同通訊作者。該研究工作由北京大學(xué)和四川大學(xué)共同合作完成，并且得到了國家自然科學(xué)基金委員會、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心，以及北大-清華聯(lián)合中心的資助。

湯富酬研究員簡介

湯富酬，現(xiàn)為北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院BIOPIC中心研究員。1994 - 1998 , 本科畢業(yè)于北京大學(xué)，1998 - 2003 在北大獲得細(xì)胞生物學(xué)博士學(xué)位，2004 - 2010，英國劍橋大學(xué)Gurdon研究所，博士后， 2010年回國在北京大學(xué)組建實驗室，2015 - 現(xiàn)在 ,北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心PI。主要從事人類早期胚胎發(fā)育的單細(xì)胞功能基因組學(xué)研究。在上系統(tǒng)發(fā)展了單細(xì)胞功能基因組學(xué)研究體系，并利用這一技術(shù)體系對人類早期胚胎發(fā)育進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究，揭示了人類早期胚胎DNA去甲基化過程的異質(zhì)性以及其他關(guān)鍵特征，發(fā)現(xiàn)了人類早期胚胎中基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的重要表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)理，為人們提供了一個全面分析人類早期胚胎DNA甲基化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究框架，加深了對人類原始生殖細(xì)胞的發(fā)育以及表觀遺傳重編程過程的認(rèn)識。現(xiàn)已發(fā)表論文40多篇，被同行引用3000多次。其中20多篇論文是以通訊（或者共同通訊）作者身份發(fā)表在Cell，Nature，Science，Cell Stem Cell，Cell Research，Genome Research，Genome Biology等期刊上。其中兩項工作獲評2014年度中國科學(xué)進(jìn)展，2015年度中國科學(xué)進(jìn)展，以及2015年度生命科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)展。

郭帆研究員簡介

郭帆，博士，現(xiàn)任四川大學(xué)華西第二醫(yī)院研究員（PI）。2008年本科畢業(yè)于武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2014年在中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所獲得理學(xué)博士學(xué)位（導(dǎo)師：徐國良院士）；2014.04-2016.12在北京大學(xué)生物動態(tài)光學(xué)成像中心從事博士后研究（導(dǎo)師：湯富酬研究員）；2017.01-至今任四川大學(xué)華西第二醫(yī)院研究員。主要研究方向：基于單細(xì)胞功能基因組學(xué)測序技術(shù)、基因編輯技術(shù)以及干細(xì)胞體外定向分化技術(shù)等方法研究胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生過程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。郭帆研究員近幾年在表觀遺傳學(xué)、單細(xì)胞表觀多組學(xué)測序等方面做出了一些列出色的工作，以*作者或通訊作者身份在Nature、Cell、Cell Stem Cell、Cell Research等雜志上發(fā)表多篇研究論文。其中，以*作者身份完成的Cell論文，入選“2015年度中國科學(xué)進(jìn)展”，“2015年度中國高?？萍歼M(jìn)展” 以及“2015年度中國生命科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)展”。

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