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【小翊實(shí)驗(yàn)手帳】The Choice of RT-qPCR：One-step or Two-step
作為一個(gè)進(jìn)實(shí)驗(yàn)室不久的實(shí)驗(yàn)小白，zui近實(shí)驗(yàn)室?guī)熜中沦徺I了一步法定量試劑，而我一直使用的是“先反轉(zhuǎn)錄再定量”，那一步法定量試劑又是什么鬼？
為了跟上大師兄的腳步，不拖實(shí)驗(yàn)室后腿，我學(xué)習(xí)總結(jié)了以下材料。
實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，即qRT-PCR或qPCR），是對(duì)基因和基因轉(zhuǎn)錄水平（即RNA）定量的重要方法。對(duì)于RNA的定量，需反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription，即RT）和定量（qPCR）兩個(gè)過程。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作步驟的不同，可分為：One-step RT-qPCR、Two-step RT-qPCR。
One-step RT-qPCR
實(shí)驗(yàn)過程：RT與qPCR在同一個(gè)反應(yīng)管中，可實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA的直接定量。
實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)點(diǎn)：1、多樣本基因定量：在市面上的預(yù)混液（如師兄買的小翊家的One-step RT-qPCR SYBR® Green Kit）基礎(chǔ)上，配制含待測(cè)基因上下游引物的Mix，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同待測(cè)樣本同一基因的檢測(cè)。2、污染幾率低：較少的加樣次數(shù)，有效降低體系配制過程中組分污染的幾率；3、操作簡(jiǎn)便，節(jié)省時(shí)間。
考慮到RT和qPCR均是酶促反應(yīng)，核心酶是Reverse Transcriptase和DNA Polymerase。而兩個(gè)酶促反應(yīng)在同一體系下進(jìn)行，必然會(huì)犧牲其中之一的性能，因此該方法存在以下缺點(diǎn)：1、RT過程：①對(duì)模板RNA質(zhì)量要求高：RNA質(zhì)量的優(yōu)劣嚴(yán)重影響逆轉(zhuǎn)錄效率；②模板使用量較大：一步法qRT-PCR使用基因特異性引物，而兩步法qRT-PCR的RT過程使用Oligo dT和Random Primerzui適比例混合液作為引物，就反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量而言，基因特異性引物低于Oligo dT和Random Primer；③易造成引物二聚體的形成：在37-50℃條件下，上下游引物3’末端易發(fā)生退火，而Reverse Transcriptasezui適酶活溫度恰恰多為37-50℃。2、qPCR過程：①若為染料法定量，引物二聚體會(huì)干擾定量結(jié)果；②DNA聚合酶酶活受到逆轉(zhuǎn)錄體系中某些組分的抑制，影響擴(kuò)增效率。
精明的科學(xué)家們通過對(duì)RT Enzymes和DNA Polymerase結(jié)構(gòu)改造，優(yōu)化酶反應(yīng)離子環(huán)境，減少抑制成分，實(shí)現(xiàn)RT和qPCR反應(yīng)均以足夠大的效率在同一體系中進(jìn)行。
Two-step RT-qPCR
圖3.兩步法RT-qPCR反應(yīng)體系與過程
對(duì)于絕大多數(shù)同學(xué)來講，是進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室學(xué)到的zui基礎(chǔ)zui經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)過程是：先RT，后qPCR，通過定量cDNA，對(duì)RNA間接定量。
實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)點(diǎn)：RT過程：1、RNA要求寬泛：大多數(shù)RT Enzymes可使用1ng-1μg起始模板量總RNA率逆轉(zhuǎn)錄（實(shí)驗(yàn)室常買的是小翊家的HifairTM RT Enzymes可兼容1pg-5μg起始模板量總RNA）;2、應(yīng)用廣泛：cDNA可用于文庫構(gòu)建或基因克隆等。qPCR過程：1、擴(kuò)增效率高：RT過程產(chǎn)生的cDNA，可經(jīng)5-20倍稀釋，zui大程度上減少對(duì)定量反應(yīng)的抑制；2、高通量多基因定量：逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣品，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因檢測(cè)。
該方法將RT和qPCR兩種酶促反應(yīng)分開進(jìn)行，更便于RT Enzymes和DNA Polymerase酶活性的釋放。但分步操作會(huì)耗時(shí)較長(zhǎng)、需多次加樣移液，可能會(huì)增大產(chǎn)生誤差和交叉污染的幾率。
One-Step or Two-Step？
我統(tǒng)計(jì)了兩種方法的特點(diǎn)及應(yīng)用，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，更好的選擇定量方法。
| One-step Real-Time-qPCR | Two-step Real-Time-qPCR |
RT反應(yīng)的引物 |
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優(yōu)勢(shì) | 1.高通量樣本的基因定量 2.減少移液的次數(shù)，降低污染的幾率 | 1.RNA、DNA均可作為模板定量 2.定量范圍寬廣，檢測(cè)靈敏度高 3.高通量基因定量 4.分步進(jìn)行，中間產(chǎn)物cDNA用途廣泛 5.分步進(jìn)行，可優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄過程和擴(kuò)增過程 |
注意事項(xiàng) | 1.模板RNA要求較高 2.引物要求高 3.樣本不適合 | 1.防止多步操作帶來的誤差和污染 2.樣本量多時(shí)，工作量大 |
*選擇 | 1.多樣本的單個(gè)基因分析 | 1.對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)基因的擴(kuò)增 2.需要重復(fù)利用cDNA進(jìn)行更多的擴(kuò)增 |
附小翊家的產(chǎn)品：
One-step RT-qPCR SYBR® Green Kit：Cat.1125
HifairTM RT Enzymes：Cat.1110、11111
