凋亡早期檢測

——Annexin-V呈現(xiàn)檢測結(jié)果

一 背景介紹 

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）一般是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡過程。 細(xì)胞凋亡途徑中各事件的發(fā)生是有時(shí)序性的，即各事件按先后順序依次發(fā)生，zui終導(dǎo)致凋亡小體的出現(xiàn)，細(xì)胞隨后發(fā)生凋亡。

凋亡早期

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphotidylserine, PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS由細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

檢測方法：用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標(biāo)記的 Annexin-V 作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。另外，碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將 Annexin-V 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

使用反饋

熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)：

Q：光補(bǔ)償調(diào)節(jié)的原則？

A: 1）用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臉颖颈仨殕稳尽?/span>

2）用來調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臒晒馑乇仨毰c實(shí)驗(yàn)用的熒光素一樣（例如不能用FITC調(diào)節(jié)EGFP的補(bǔ)償）。

2）橫平豎直：理論上X-Mean或者Y-Mean要相等（如下圖所示），但在實(shí)際操作中，只需要保證單染的細(xì)胞不跨區(qū)存在。

Q：如何進(jìn)行光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)？ 

A：進(jìn)行熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)，需要設(shè)置幾組對(duì)照實(shí)驗(yàn)。以AnnxinV-FITC/PI雙染試劑盒為例；

1）空白對(duì)照組：不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞，用于電壓的調(diào)節(jié)，調(diào)整前向散射和側(cè)向散射，得到清晰劃分的細(xì)胞群體。

2）凋亡誘導(dǎo)的單染組：陽性對(duì)照的細(xì)胞群體需要超過分析的細(xì)胞群體的10%，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。 

3）雙染實(shí)驗(yàn)組：利用空白對(duì)照組和單染組調(diào)節(jié)好的參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得。

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三 常見問題與解答

Q：Annexin V/ PI 試劑盒能否檢測除人以外其他動(dòng)物細(xì)胞凋亡情況？

A：可以。因?yàn)锳nnexin V 是與磷脂酰絲氨酸（PS）的結(jié)合，而PS不存在種屬間差異。

Q：使用Annexin V/ PI 試劑盒進(jìn)行凋亡檢測，用含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞對(duì)結(jié)果有影響嗎？

A：會(huì)。因?yàn)锳nnexin V 是Ca²⁺ 依賴的蛋白，EDTA會(huì) 螯合Ca²⁺從而影響Annexin V與PS 的結(jié)合，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q：如果細(xì)胞自帶GFP蛋白，請問哪種凋亡檢測試劑盒適用該細(xì)胞的凋亡檢測？

A：選用PE標(biāo)記或者APC標(biāo)記的Annexin V凋亡檢測試劑。

Q：對(duì)于來自血液的細(xì)胞樣品，為什么去除血液中的血小板？

A：因?yàn)檠“逯泻蠵S，其能與Annexin V結(jié)合進(jìn)而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q：Annexin -V 在實(shí)驗(yàn)操作上應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？

A：由于Annexin -V上帶有熒光基團(tuán)，實(shí)驗(yàn)上應(yīng)盡量避光操作和孵育；為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性應(yīng)在染色后1h內(nèi)上機(jī)檢測。

四 部分使用客戶已發(fā)表文章

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