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活體成像之熒光素

2017-12-18  閱讀(4821)

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D-熒光素

原理

D-熒光素(D-Luciferin)是熒光素酶(Luciferase)的常用底物,普遍應(yīng)用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其是體內(nèi)活體成像技術(shù)。其作用機(jī)制是在ATP和熒光素酶的作用下,熒光素(底物)能夠被氧化發(fā)光。當(dāng)熒光素過(guò)量時(shí),產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性(見(jiàn)下圖)。

說(shuō)明: C:\Users\qcbio\Desktop\生化發(fā)光反應(yīng)式.tif

將攜帶熒光素酶編碼基因(Luc)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后,導(dǎo)入研究動(dòng)物如大、小鼠體內(nèi),之后注入熒光素,通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)(BLI)來(lái)檢測(cè)光強(qiáng)度變化,從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對(duì)此反應(yīng)體系的影響,根據(jù)生物發(fā)光強(qiáng)度的變化來(lái)指示能量或生命體征。

分類

 

D-Luciferin, Sodium Salt

D-Luciferin,Potassium Salt 

D-Luciferin Firefly, Free Acid

分子式

NaC11H7N2O3S2 · H2O

C11H7N2O3S2 K

C11H8N2O3S2

分子量

320.32 g/mol

318.42 g/mol

280.33 g/mol

外觀

淡黃色粉末

淡黃色粉末

類白色至淺黃色粉末

溶解性

易溶于水(100 mg/ml

易溶于水(60 mg/ml

本品難溶于水,除非加入稀堿促進(jìn)其溶解。

純度

99.7%

99.7%

99%

使用方法

1)體外實(shí)驗(yàn):

a儲(chǔ)存液配置:1 g的熒光素鈉鹽或鉀鹽溶解于33.3 ml水中,制備成30 mg/ml的儲(chǔ)存液?;靹?,0.2μm濾膜過(guò)濾(可吹入惰性氣體,如氮?dú)?,以防止氧化。?/span>-80℃避光保存,一年內(nèi)有效。

b使用:在冰上避光解凍(若是在冰上比較難解凍,可短暫溫浴,并輕柔混勻)。用培養(yǎng)基以1:200的比例稀釋儲(chǔ)存液為150μg/ml去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無(wú)殘留。④待圖像分析前,向細(xì)胞內(nèi)添加1×熒光素工作液,然后進(jìn)行圖像分析(或者細(xì)胞放在37℃短時(shí)間孵育約5min后檢測(cè)可增強(qiáng)信號(hào))

2)活體成像:

a工作液配置:溶解1 g熒光素鉀鹽或鈉鹽于66.6 ml 無(wú)Ca2+Mg2+DPBS中,配置成15 mg/ml的溶液。混勻,0.2μm濾膜過(guò)濾(可吹入惰性氣體,如氮?dú)?,以防止氧化。?/span>-80℃避光保存,一年內(nèi)有效。

b使用:在冰上避光解凍(若是在冰上比較難解凍,可短暫溫浴,并輕柔混勻)。

按照動(dòng)物體重150 mg/kg進(jìn)行注射,(例如,20 g重的小鼠需要注射200μl

注射入體內(nèi)10-20 min(待光信號(hào)達(dá)到zui強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期),再進(jìn)行成像分析。

注:建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線,從而確定zui高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。

注射方法

1)腹腔注射:

將底物注射入腹腔中。推薦劑量為150 mg/Kg(例如,20 g重的小鼠需要注射200μl )。使用25 G的針頭,1 ml注射器。

其方法如下示意圖:

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

進(jìn)針5 mm,斜向上30°角。

2)靜脈注射:

小鼠的靜脈注射通常是在小鼠的尾部或者眼眶靜脈注射。靜脈注射的推薦劑量同腹腔注射,150 mg/Kg。注射液體的zui大體積不可超過(guò)血容量的10%。一般對(duì)于20 g 小鼠其血容量為2 ml,故其zui大注射量應(yīng)為200μl。使用1 ml注射器26 G針頭,或者使用胰島素注射器28 G針頭,確保注射器中無(wú)氣泡。注射前將動(dòng)物置于加熱燈下約5 min,或者將尾巴浸泡于溫水中以擴(kuò)張血管。操作時(shí)將小鼠固定于鼠筒或者燒杯中,乙醇消毒尾部,緩慢注射。

客戶實(shí)例

說(shuō)明: 圖4

TIPE2抗炎因子在乳腺癌動(dòng)物模型中的抗腫瘤治療作用

選自文獻(xiàn):Zhang Z, Li L, Cao S, et al. Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8 +, T and NK cell-mediated antitumor responses[J]. Molecular Immunology, 2017, 85:230.

FAQ

Q1: 熒光素的純度對(duì)實(shí)驗(yàn)有成影響嗎?

A有影響。99%以上的純度較好。

Q2: 甲蟲(chóng)熒光素和螢火蟲(chóng)熒光素之間有區(qū)別嗎?

A二者之間沒(méi)有區(qū)別。

Q3: 如何溶解熒光素,其溶液穩(wěn)定嗎?

A熒光素鉀鹽在水中的溶解度為60 mg/ml,熒光素鈉鹽溶解度為100 mg/ml。熒光素游離酸是不溶于水的,但是在甲醇中的溶解度為10 mg/ml,在DMSO中溶解度為50 mg/ml。

熒光素鈉鹽和鉀鹽的水溶液短期內(nèi)存放于-80℃,對(duì)實(shí)驗(yàn)效果沒(méi)有明顯影響。有實(shí)驗(yàn)證明,將熒光素溶解于脫氧中的水中會(huì)更穩(wěn)定些。

對(duì)于一些較為敏感的試驗(yàn),為了控制試驗(yàn)中的可變因素,較推薦新鮮配置的反應(yīng)液 。例如,低濃度的熒光素酶或者并非zui適的反應(yīng)條件是需要高質(zhì)量的底物才能進(jìn)行反應(yīng) 

Q4: 熒光素鈉鹽和熒光素鉀鹽有什么區(qū)別?

A目前的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)二者在使用效果上的區(qū)別,僅在物理特征上有些小的差別,如熒光素鈉鹽溶解度會(huì)高于熒光素鉀鹽。但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中,有更多的研究者傾向于選擇熒光素鉀鹽,據(jù)不*統(tǒng)計(jì),選用鉀鹽的使用人是鈉鹽使用人的3倍。

Q5: 熒光素鈉鹽,熒光素鉀鹽,和熒光素游離酸之間有什么區(qū)別?

A游離酸不溶于水,在甲醇中的溶解度為10 mg/ml,在DMSO中溶解度為50 mg/ml,同樣可用 NaOH,KOH弱堿去調(diào)節(jié)溶液的PH值。熒光素的鈉鹽或者鉀鹽在使用過(guò)程中會(huì)更方便,尤其是在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中,因其能夠溶解在水中,反應(yīng)毒性也會(huì)更小些。

Q6: 為什么溶解熒光素鈉鹽或者鉀鹽的時(shí)候需用不含Ca2+Mg2+離子的PBS,有無(wú)別的鹽溶液可用來(lái)溶解熒光素?

APBS,或者其他的磷酸鹽緩沖液,或DPBS,常用來(lái)進(jìn)行生物學(xué)研究或者細(xì)胞相關(guān)研究。PBS/DPBS為等滲溶液,PH7.2-7.6之間。DPBSPBS之間無(wú)差別,只是通常情況下,DPBS是不含鈣鎂離子。鈣鎂離子可能會(huì)抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg2+是催化熒光氧化的重要因素,Ca2+是和腔腸素氧化有關(guān)的離子。其他的鹽溶液也可用來(lái)溶解熒光素,但要避免溶液中的陽(yáng)離對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。

Q7: 熒光素酶的發(fā)光特性?

A熒光素腹腔注射老鼠后約1 min后,能夠表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開(kāi)始發(fā)光,10 min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的zui高點(diǎn),在zui高點(diǎn)持續(xù)約20-30 min后開(kāi)始衰減,約3 h后熒光素排除,發(fā)光全部消失,的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15-35 min內(nèi)。其動(dòng)力學(xué)曲線如下圖:

Q8: 怎么將熒光素注入小鼠體內(nèi),注射方法之間的區(qū)別是什么?

A熒光素可通過(guò)腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內(nèi)。約1 min可擴(kuò)散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg。對(duì)于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可。對(duì)于腹腔注射來(lái)講,擴(kuò)散較慢,開(kāi)始發(fā)光較慢,持續(xù)發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)于熒光素的尾部靜脈注射,擴(kuò)散快,開(kāi)始發(fā)光快,但發(fā)光持續(xù)時(shí)間較短。

Q9: 熒光素底物可以透過(guò)血腦屏障嗎?

A熒光素底物約280道爾頓,熒光素的水溶性和脂溶性都非常好,很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。

Q10: 熒光素酶的表達(dá)穩(wěn)定性如何?

A通過(guò)穩(wěn)定篩選等過(guò)程,熒光素酶基因是能夠插到細(xì)胞染色體內(nèi)的。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí),熒光素酶也得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá),熒光素酶的半衰期約為3 h,故只有活細(xì)胞才能持續(xù)表達(dá)熒光素酶。

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品編碼

規(guī)格

價(jià)格(元)

D-Luciferin, Sodium Salt D 熒光素鈉鹽

40901ES01/02/03/08/10

0.1/0.5/1/5/10 g

1008/2556/3996/15876/31212

D-Luciferin, Potassium Salt D 熒光素鉀鹽

40902ES01/02/03/08

0.1/0.5/1/5 g

1000/2600/3996/14898

D-Luciferin Firefly, Free Acid D 螢火蟲(chóng)熒光素,游離酸

40903ES01/02/03

0.1/0.5/1

708/2556/3588

Coelenterazine Native 天然腔腸素

40904ES02/03/08

0.5/1/5 mg

589/1049/3899

Coelenterazine 400 a腔腸素 400a

40905ES02/03

0.5/1 mg

789/1499

Coelenterazine h 腔腸素h

40906ES02/03/08

0.5/1/5 mg

1329/2359/6759

Ready To Use Coelenterazine h 即用型腔腸素h

40907ES10

10 vials

6856

Coelenterazine f 腔腸素f

40908ES02/03

0.5/1 mg

1329/2359 

Coelenterazine cp 腔腸素cp

40909ES72

250 μg

2359.00

Coelenterazine hcp 腔腸素hcp

40910ES72

250 μg

2359.00

Coelenterazine n 腔腸素n

40911ES72

250 μg

2359.00

Coelenterazine e 腔腸素e

40912ES02/03

0.5/1 mg

1329/2359

Coelenterazine 2-methyl 二甲基腔腸素

40913ES50

50 μg

929

Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒

11402ES60/80

100/1000

536/4236

Luciferase Reporter Gene Assay Kit

螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒

11401ES60/76/80

100/500/1000

349/969/1748

 

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