Total Nitric Oxide Assay Kit (Colorimetric)

總一氧化氮（NO）檢測試劑盒（比色法）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

總一氧化氮檢測試劑盒（Total Nitric Oxide Assay Kit, 即Nitrate/Nitrite Assay Kit）采用了硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase）還原硝酸鹽（nitrate）為亞硝酸鹽（nitrite），然后通過經(jīng)典的Griess reagent檢測亞硝酸鹽，從而測定出總一氧化氮。一氧化氮本身極不穩(wěn)定，在細胞內很快代謝為硝酸鹽和亞硝酸鹽，通過上述方法檢測出所有的硝酸鹽和亞硝酸鹽的量，就可以推算出總的一氧化氮的量。

本試劑盒采用的是NADPH依賴性硝酸鹽還原酶（NADPH-dependent nitrate reductase）。高濃度的NADPH會干擾后續(xù)的檢測，因此在Griess Reagent檢測之前需要消除過量NADPH對后續(xù)試驗的干擾。乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase, LDH）是常用的NADPH消除試劑，通過其清除作用，保證了檢測結果的準確性。

本試劑盒具有以下特點。1）檢測靈敏度高：對亞硝酸鹽的檢測下限達到2 μmol/L，在2-80 μmol/L的范圍內有很好的線性關系。濃度過高的樣品可以適當稀釋后再進行檢測。2）適用范圍廣：能檢測各種樣品，包括細胞、組織、細胞或組織的培養(yǎng)液、血清、血漿或尿液等。3）抗干擾能力強：酚紅和10%血清對測定無明顯干擾。4）樣品用量少：僅需0-60 μL樣品，取決于樣品內一氧化氮的濃度。5）檢測周期短：僅需約80 min即可完成檢測。

產(chǎn)品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，有效期一年。反應輔酶配制成溶液后必須分裝并-70℃保存。

注意事項

1）含有較高濃度硝酸鹽的培養(yǎng)液，如RPMI 1640，易對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，請盡量避免。必須使用RPMI 1640培養(yǎng)液時，在檢測一氧化氮前必需先換成其他適當培養(yǎng)液如；DMEM、MEM、F12等，或HBSS或PBS緩沖液等。

2) 檢測反應必須避光進行。

3) 由于檢測過程中涉及還原反應，因此影響還原反應的氧化或還原試劑要注意避免，如還原劑DTT和巰基乙醇。

檢測步驟

1. 樣品處理

含有高濃度蛋白的樣品如血清、含有高濃度血清的細胞培養(yǎng)液等，在加入Griess Reagent I后可能產(chǎn)生沉淀?？扇?/span>50 μL樣品，加入50 μL Griess Reagent I進行測試，觀察是否產(chǎn)生沉淀。如產(chǎn)生沉淀，可把樣品沸水浴加熱5 min，以變性蛋白，然后12,000 g離心5 min，取上清用于后續(xù)的測定。對于細胞或組織樣品可以使用無蛋白酶或者磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液進行裂解。對于尿液樣品，通常需要用水稀釋10-50倍后檢測。不宜使用肝素抗凝的血漿，肝素抗凝的血漿在和Griess Reagent反應時會產(chǎn)生沉淀。

2. 稀釋標準品

用制備或者稀釋樣品所使用的溶液把1 M亞硝酸鹽標品稀釋成 2、5、10、20、40、60、80 μmol/L。例如樣品為細胞裂解液，則用該裂解液稀釋標準品；樣品為細胞培養(yǎng)液，則用該培養(yǎng)液稀釋標準品。如果樣品為血清，則可以使用本試劑盒提供的反應緩沖液（50107-A)或使用 PBS、生理鹽水等適當溶液稀釋標準品。 

3. 試劑的準備

a. 加入約1 mL蒸餾水或MilliQ級純水至5 mg 反應輔酶（50107-B）中，顛倒混勻溶解后，再用蒸餾水或MilliQ級純水定容至3 mL，配制成2 mM反應輔酶溶液，除實驗所需外，其余反應輔酶溶液必須立即分裝后-70℃凍存。

b. 反應增強子（50107-C）已經(jīng)配制在適當溶液中。反應增強子可以適當分裝后-20℃或-70℃保存。

c. 硝酸還原酶（50107-D）和LDH（50107-F）在臨用前取出，并放置在冰浴上使用（注意在使用完畢后立即-20℃保存）。試劑盒中的其余各種試劑在溶解后保存在冰浴上。Griess Reagent I和Griess Reagent II在使用前需達到室溫。

4. 參考下表依次加入標準品、樣品和檢測試劑并進行相應檢測：

【注】：a. 反應必須避光進行。如果使用96孔板進行檢測，可以使用鋁箔紙包裹96孔板進行避光。

b. 樣品的用量上限為60 μL，血清、血漿或組織勻漿液通常使用40 μL。樣品不足60 μL時，不同樣品之間的體積能保持*，體積不足的部分用用于樣品稀釋的溶液補足。用于樣品稀釋的溶液是指實際用于樣品稀釋的溶液或裂解樣品的溶液。標準品可以參考上表直接使用60 μL。

c. 可以同時設置加入200 μL水或PBS的2-3個孔為陰性對照，此2-3個孔只需加入水或PBS即可。

d. *部分37℃孵育30 min后，直接參考上表依次加入LDH緩沖液和LDH，并進行后續(xù)孵育。

e. 第二部分37℃孵育30 min，直接參考上表依次加入Griess 試劑I和Griess 試劑 II。加入Griess試劑 I后需要輕輕混勻。

f. 每次混勻后，可以1000-3000 g離心數(shù)秒，把液體沉淀到管底。同時需避免各檢測孔中產(chǎn)生氣泡，以免氣泡干擾檢測結果。

g. 檢測時，如無540 nm濾光片，520-560 nm的濾光片也可以使用。如無酶標儀或合適的濾光片，也可以通過數(shù)碼相機拍照后在適當圖形軟件中進行定量分析，并確定樣品中一氧化氮的濃度。拍照比色時標準品需要更為精細的濃度梯度。

5. 根據(jù)標準品曲線計算出樣品中一氧化氮的濃度。

常見問題

1. 檢測結果標準曲線良好，但樣品的吸光度很低，和空白對照接近。

標準曲線良好說明檢測方法和檢測試劑盒基本上沒有問題，樣品吸光度低說明樣品中一氧化氮含量很低?？梢圆扇〉霓k法是：（1）加大樣品和標準品的使用量至60 μL，其余試劑用量不變。（2）把整個檢測體系每種試劑的用量加大50%，這樣可以使檢測靈敏度增加約50%。如果上述方法還不能解決問題，可以考慮濃縮樣品，即一方面在收集樣品的時候盡量使一氧化氮的濃度保持得較高（例如裂解細胞時采用較小體積的裂解液）；另一方面可以考慮用真空干燥或真空冷凍干燥的方法濃縮樣品。對于培養(yǎng)的細胞，通常上清液測定出來的吸光度相對較低，而細胞裂解液測定出來的吸光度會稍高一些。

2. 檢測時發(fā)現(xiàn)每個樣品的吸光度都非常高。

在使用RPMI 1640培養(yǎng)液時會發(fā)生這種情況。因為RPMI 1640培養(yǎng)液中含有高濃度的硝酸鹽從而會使樣品檢測出來的吸光度都非常高。其他含有高濃度硝酸鹽的試劑也會產(chǎn)生類似情況，影響氧化還原反應的試劑也可能產(chǎn)生類似干擾。使用過程中避免使用RPMI 1640等可能導致干擾檢測的試劑即可。

HB171113