Reactive Oxygen Species Assay Kit

活性氧（ROS）檢測試劑盒

產(chǎn)品信息

檢測原理

活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種基于熒光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate）的熒光強(qiáng)度變化，定量檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的zui常用方法。

DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不會通透細(xì)胞膜，因此探針很容易被積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧能夠氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。綠色熒光強(qiáng)度與活性氧的水平成正比。在zui大激發(fā)波長480 nm，zui大發(fā)射波長525 nm處，使用熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等檢測熒光信號。Rosup為活性氧陽性誘導(dǎo)藥物，根據(jù)其熒光信號強(qiáng)度，可分析活性氧的真正水平。

以96孔板每孔加樣量為標(biāo)準(zhǔn)，本試劑盒可測定約1000次。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存

冰袋運(yùn)輸。-20℃干燥保存，避免強(qiáng)光直射。有效期一年。

檢測步驟

1.裝載探針

1.1 原位裝載探針（僅適用于貼壁細(xì)胞）

① 細(xì)胞準(zhǔn)備：檢測前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保檢測時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到50~70%。

【注】：必須保證細(xì)胞狀態(tài)健康，且檢測時(shí)不會過度生長。

② 藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。

（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細(xì)胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可顯著看到活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會有比較明顯差異?！救?，HeLa細(xì)胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5 h；】

③ 探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

④ 探針裝載：吸除誘導(dǎo)用藥物，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜。如，對于6孔板通常不少于1000 μL，對于96孔板通常不少于100 μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。

⑤ 細(xì)胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1~2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2 收集細(xì)胞后裝載探針：適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

① 細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，必須保證檢測用細(xì)胞狀態(tài)健康。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。

② 藥物誘導(dǎo)：將收集好的細(xì)胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物本身特性，以及細(xì)胞類型來決定。

（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細(xì)胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可顯著看到活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會有比較明顯差異?！救?，HeLa細(xì)胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5 h；】

③ 探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

④ 探針裝載：去除細(xì)胞內(nèi)藥物，離心收集細(xì)胞，加入適當(dāng)稀釋好的探針，使其細(xì)胞密度為1.0×10⁶~2.0×10⁷?！?strong>注】：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進(jìn)行調(diào)整。如，對于流式分析，單管檢測內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于10⁴，也不可多于10⁶。每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。

⑤ 細(xì)胞清洗：用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1~2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

2檢測

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。

收集細(xì)胞后裝載探針：用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3參數(shù)設(shè)置

使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

其他事項(xiàng)說明

1）對于刺激時(shí)間較短（通常2 h以內(nèi)）的細(xì)胞，也可先裝載探針，后用活性氧陽性對照和/或感興趣藥物刺激細(xì)胞，如陽性對照刺激，應(yīng)先加入適量探針于37℃避光孵育30 min；然后再加入等體積2×陽性對照Rosup溶液（200 μM），37℃避光誘導(dǎo)30 min-4 h；

2）陽性對照Rosup通常濃度為100μM。通常刺激后30 min-4 h可以觀察到顯著的活性氧水平升高。對于不同的細(xì)胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 min內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可延長誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可縮短誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)降低活性氧陽性對照的濃度。

3）對于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1∶2000～1∶5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時(shí)DCFH-DA的濃度為2～5 μM。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15～60 min內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

4）活性氧陽性對照（Rosup）僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個(gè)樣品中都需加入活性氧陽性對照。

注意事項(xiàng)

1） 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。

2） 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。

3） 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

4） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。