產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff Clone^® Plus One Step Cloning Kit是一款簡便、快速、高效的DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應20 min即可進行轉化，完成定向克隆?？寺￡栃月士蛇_95%以上。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品應用

快速克?。欢ㄏ蚩寺?；定點突變。

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，有效期1年。

注意事項

1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

2）本產(chǎn)品僅作科研用途！

實驗流程    

圖1. Hieff Clone^® 一步法快速克隆試劑盒實驗流程圖。

一. 制備線性化載體

選擇合適的克隆位點，并對載體進行線性化。建議盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區(qū)域進行克隆。載體克隆位點上下游25 bp區(qū)域內GC含量均在40%-60%范圍內最佳。線性化載體可通過限制性內切酶酶切或反向PCR擴增獲得。

1.酶切制備線性化載體
1）雙酶切線性化：線性化*，轉化背景低。建議使用。
2）單酶切線性化：線性化程度較差?？蛇m當延長酶切時間以降低轉化背景。
注：不含插入片段的假陽性克隆是由未線性化環(huán)狀載體轉化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。

2.反向PCR擴增制備線性化載體

建議使用高保真聚合酶（如：Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）進行載體擴增，以減少擴增突變的引入。PCR擴增模板應盡量使用預線性化質粒，以防止殘留環(huán)狀質粒模板對克隆陽性率的影響。

Hieff Clone® 重組反應體系兼容幾乎所有酶切反應體系和常規(guī)PCR反應體系，當載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴增產(chǎn)物純度較高時，可以無需純化，直接進行重組反應。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質粒時，建議使用高質量的試劑盒對線性化載體進行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。

二. PCR擴增制備插入片段

1.設計擴增引物

Hieff Clone® 引物設計方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。

插入片段正向擴增引物設計方式：

5’—上游載體末端同源序列+酶切位點（可保留或刪除）+基因特異性正向擴增引物序列—3’

插入片段反向擴增引物設計方式：
3’—基因特異性反向擴增引物序列+酶切位點（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’

【注】：
①基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；
②上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。推薦使用用翌圣無縫克隆引物設計軟件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動生成插入片段的擴增引物。若手動設計，可參照以下實例。

1）如載體選用雙酶切線性化（Hind III + EcoR I）：

2）如載體選用單酶切線性化（BamH I）：

3）如載體選用反向PCR擴增制備：

圖2. 插入片段引物設計方案

【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進行引物合成。計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。

2.插入片段PCR擴增

插入片段擴增可用任意PCR酶擴增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進行擴增（Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。

PCR擴增結束后，取少量產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗擴增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone™重組反應體系兼容常規(guī)PCR反應體系。因此，如果擴增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴增產(chǎn)物可以無需純化，直接用于重組反應。但PCR擴增產(chǎn)物純度較低時，建議使用高質量的試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。

三. 線性化載體與插入片段濃度測定

推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對DNA進行定量。將線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物做數(shù)個等體積稀釋梯度，原始產(chǎn)物和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標準（DNA Marker）比較條帶亮度以確定其近似濃度。

四. 重組反應

1. 線性化載體與插入片段使用量計算

Hieff Clone® 重組反應體系最適載體使用量為0.03 pmol；最適載體與插入片段摩爾比為1:2-1:3，即最適插入片段使用量為0.06-0.09 pmol。這些摩爾數(shù)對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：

最適載體使用量 = [0.02×載體堿基對數(shù)]ng (0.03 pmol)

最適插入片段使用量 = [0.04×插入片段堿基對數(shù)]ng (0.06 pmol) 或= [0.06×插入片段堿基對數(shù)]ng (0.09 pmol)

例如，將長度為2 kb的插入片段克隆至長度為5 kb的載體時，載體的最適使用量應為：0.02 × 5000 = 100 ng；插入片段最適使用量應為：0.04 × 2000 = 80 ng或0.06 × 2000=120 ng。
注：
1）當插入片段長度大于載體時，最適載體與插入片段使用量的計算方式應互換，即插入片段當做載體，載體當做插入片段進行計算。
2）線性化載體的使用量應在50-200 ng之間；插入片段擴增產(chǎn)物的使用量應在20-200 ng之間。當使用上述公式計算最適使用量超出這個范圍時，則選擇低或高使用量即可。
3）線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。

2.反應體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）

注：
1）X和Y分別是根據(jù)公式計算得到線性化載體和插入片段用量。

2）陰性對照-1可用來確認線性化載體有無環(huán)狀質粒殘留，可選擇性進行。
3）當插入片段擴增模板是與載體抗性相同的環(huán)狀質粒時，可用陰性對照-2來確認有無環(huán)狀質粒模板殘留，可選擇性進行。

4）試劑盒中提供陽性對照反應所需組分，可用來排除其他實驗材料及操作因素的影響，可選擇性進行。

3.重組反應

1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應液收集至管底。
2）置于50℃反應20 min。當插入片段＞5 kb時，可將孵育溫度延長至25 min。
注：建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進行反應。

3）待反應完成后，建議將反應管置于冰上冷卻5 min，以防溫度過高降低感受態(tài)轉化效率。

4）反應產(chǎn)物可直接進行轉化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。

五. 重組產(chǎn)物轉化、涂板

1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat No. 11802ES）。

2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。

3）42℃熱激90秒，冰浴孵育2 min。

4）加入900 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復蘇。37℃，200 rpm，搖菌45 min。
5）5000 rpm離心3 min，棄掉900 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

六. 克隆鑒定

方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測序引物進行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測序鑒定。

應用實例

                             
圖3：Hieff Clone^® Plus One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長度的單片段基因。

A-D：重組轉化平板。E：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb，載體與插入片段摩爾比：1:3，重組反應條件：50℃，20 min。

常見問答

1、最佳克隆位點選擇？
答：在選擇克隆位點時，應避免選擇克隆位點上下游50 bp內有重復序列的區(qū)域。當克隆位點上下游25 bp區(qū)域內GC含量均在40%-60%范圍內時，重組效率將達到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會受到較大影響。

2、無克隆長出或克隆數(shù)較少？

答：出現(xiàn)該情況，建議同時使用試劑盒所附帶的陽性對照，可排除試劑盒本身的影響，并進行進一步判定，主要有以下可能情況：

1）引物設計不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點+基因特異性擴增引物】，GC含量40% - 60%。

2）感受態(tài)細胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細胞，確保其轉化效率>107 cfu/μg。每次操作時可設置一組轉化質粒的對照實驗，以檢測感受態(tài)細胞的轉化效率。選擇克隆感受態(tài)細胞(如DH5α)，不能選擇表達感受態(tài)細胞。

3）線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物的使用量不足/過量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應體系。

4）線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物不純，抑制反應：線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。建議線性化載體、插入片段擴增產(chǎn)物進行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH2O中。

3、出現(xiàn)較多假陽性

答：主要有以下可能情況：

1）載體線性化不*：即使是痕量未*酶切的載體也會產(chǎn)生很高的轉化背景?？赏ㄟ^陰性對照檢測載體是否線性化*，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質粒殘留。

2）插入片段擴增產(chǎn)物混有非特異擴增產(chǎn)物：建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。

3）反應體系中混入了相同抗性的質粒：PCR擴增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質粒時，若擴增產(chǎn)物直接用于重組反應，殘留環(huán)狀質粒模板會產(chǎn)生較高的轉化背景。建議使用預線性化質粒作為擴增模板、擴增產(chǎn)物進行DpnI消化或擴增產(chǎn)物進行膠回收純化。

4、菌落PCR無條帶

答：主要有以下可能情況：

1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進行菌落PCR檢測。

2）PCR體系或程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質粒條帶，建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質粒，以質粒做模板PCR驗證；或者進行酶切驗證。

3）重組失敗：沒有目的條帶，只有空質粒的條帶，說明重組不成功，載體線性化不*，建議優(yōu)化酶切體系。

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