Rhod-2, AM,Cell Permeable 細(xì)胞可滲透鈣離子熒光探針

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Rhod-2是一種可見光激發(fā)的高親和力Ca²⁺指示劑，與其他可見光激發(fā)熒光探針如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有長波長，更適用于檢測具有較高自熒光現(xiàn)象的細(xì)胞和組織內(nèi)鈣離子水平以及檢測由光感受器和籠鎖鈣離子螯合劑光激活導(dǎo)致的鈣離子釋放。

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發(fā)Ca²⁺探針具有以下特點：1）可被大多數(shù)設(shè)備的激發(fā)器有效激發(fā)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細(xì)胞儀等。2）具有更強(qiáng)的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca²⁺變化，從而降低了對活細(xì)胞的光毒性。3）Ca²⁺依賴性熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，對Ca²⁺變化水平檢測敏感度更高。4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測。5）無光譜偏移。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃避光干燥保存，有效期6個月。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

需要試劑準(zhǔn)備

1） （可選）配制Pluronic F-127母液：100 mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30 min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）Hanks•balanced salt solution

使用方法（本實驗方案僅供參考，為得到實驗結(jié)果，需根據(jù)具體的實驗情況優(yōu)化實驗條件。）

1）Rhod-2/AM儲存液的配制

利用高質(zhì)量無水DMSO溶解Rhod-2/AM配制成2-5 mM的儲存液，該儲存液可分裝于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回溫至室溫。

【注】：① 因為Rhod-2/AM在水中的溶解性和穩(wěn)定性較差，不可用水溶性緩沖液配制Rhod-2/AM儲存液。

② 溶解用的DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導(dǎo)致AM 體水解，使熒光染料無法進(jìn)入細(xì)胞，影響實驗效果。

2）Rhod-2/AM工作液的配制

利用合適緩沖液(如Hanks & Hepes )將Rhod-2/AM稀釋成1-10 μM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 mL濃度為4 µM工作液，用1 mL 緩沖液稀釋4 µl 1mM母液即可，混勻。

【注】：① 典型工作液濃度為0.1-5μM，對于大多數(shù)細(xì)胞，我們推薦加載濃度4-5 μM，具體的使用濃度需根據(jù)實驗要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用低探針濃度。

② Rhod-2/AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）（可選）如果Rhod-2/AM進(jìn)入細(xì)胞的效果不好，可向 Rhod-2/AM/DMSO 儲存液中加入適量20% Pluronic F127溶液，終稀釋至其終濃度為0.02-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Rhod-2/AM在緩沖液中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞。

【注】：Pluronic F127可降低Rhod-2/AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議將其加入儲存液長期保存。

4）取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用緩沖液洗滌細(xì)胞3次。

【注】：如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會分解 AM 體，從而降低Rhod-2/AM進(jìn)入細(xì)胞的效果。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

5）將 Rhod-2/AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。在37℃培養(yǎng)15-60 min，然后除去Rhod-2/AM工作液。

【注】：關(guān)于孵育的時間，如果*做實驗不能確定，建議先孵育30 min，看熒光效果：如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長時間。

6）用不含探針緩沖液洗滌細(xì)胞 3 次，以充分去除殘留的Rhod-2/AM工作液。然后加入緩沖液覆蓋細(xì)胞。

7）37℃培養(yǎng)箱孵育約 20-30 min，以確保 AM 體在細(xì)胞內(nèi)的*去酯化作用。

8）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞。

【注】：① 某些細(xì)胞會將熒光探針被動運(yùn)輸或分泌到胞外，在一些通過陰離子泵泄漏探針的細(xì)胞內(nèi)該現(xiàn)象尤其嚴(yán)重，此時需加入一些抑制劑防止該情況的發(fā)生，如加入適量的丙磺舒或磺吡酮。但需注意，抑制劑的加入量必須經(jīng)過優(yōu)化，過量的抑制劑也會對細(xì)胞造成不利影響。

② 某些細(xì)胞具有自體熒光會影響結(jié)果分析，需使用未加載探針細(xì)胞做對照，在結(jié)果分析時在同一波長下扣除自熒光。

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HB190625