產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細胞增殖檢測是評估細胞健康程度、遺傳毒性及抗腫瘤藥物效果的基礎(chǔ)實驗手段。常用的檢測細胞增殖方法是BrdU法。EdU法檢測是Brdu方法的升級和突破。EdU（5-溴-2-脫氧尿嘧啶）是一種嘧啶類似物，可在DNA合成期整合入DNA雙鏈。EdU法檢測是基于“點擊"反應(yīng)，一種由銅催化的疊氮化合物和炔烴的原子共價反應(yīng)。

試劑盒中EdU試劑含有炔烴，而Yefluor 488 Azide染料試劑含有疊氮化合物。點擊法的EdU標記增殖快速有效，易于使用。只需少量的疊氮化染料即可有效地標記出整合的EdU。標準化的戊二醛固定和去污劑促滲可以使檢測試劑進入細胞，而Brdu方法則需要DNA變性（如酸變性、熱變性或者用DNase消化）去暴露BrdU從而方便BrdU抗體結(jié)合。

本試劑盒包含EdU法檢測所需要的所有組份，可以檢測細胞增殖與細胞周期分析。對于細胞周期的分析，試劑盒提供了細胞核染料Hoechst 33342。

光譜特性：Yefluor 488 Azide：Ex/Em=495/519 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461nm, bound to DNA。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。-20℃避光保存，有效期1年。

注意事項

1．為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2．本產(chǎn)品僅作科研用途！

其他所需試劑

10 mM PBS, pH7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛 in PBS ）

2 mg/ml 甘氨酸溶液（去離子水配制）

促滲試劑（0.5% Triton X-100 in PBS）

3% BSA in PBS, pH7.2-7.6

去離子水

18×18 mm 蓋玻片

使用方法

1、EdU標記細胞

注意：EdU的標記濃度應(yīng)根據(jù)所用的細胞類型做相應(yīng)的優(yōu)化選擇，推薦客戶以10 μM的EdU初始濃度進行摸索。細胞培養(yǎng)基、細胞生長密度及細胞類型和其他實驗條件都有可能影響細胞的標記效果。預(yù)實驗中我們建議客戶設(shè)置一系列的EdU濃度梯度，以確定最佳的合適您的細胞的實驗濃度。

1.1. 以每孔4×10³-1×10⁵細胞接種于96孔板中，進行您所需要的藥物處理或者其他刺激處理。

1.2. 準備一份2×的EdU工作液（組分A）：以*培養(yǎng)基稀釋10 mM的儲液至合適的工作濃度。建議您以10 μM的初始工作濃度開始預(yù)實驗。

1.3. 預(yù)熱2×的EdU工作液，加入等體積的培養(yǎng)基，使?jié)舛茸優(yōu)?×(如：需要得到10 μM的終濃度，應(yīng)以新鮮培養(yǎng)基等體積加入到20 μM的EdU工作液中)。

1.4. 合適時間合適條件孵育細胞，EdU孵育細胞的時間可以直接用作測定細胞DNA合成的指標，時間點選擇以及孵育時間的長度取決于細胞生長速率。通過短暫的EdU孵育進行的脈沖式標記細胞可以用于研究細胞周期動力學(xué)。

2、細胞固定及促滲操作

2.1. 孵育完成后，去除培養(yǎng)基加入50 μL 4%中性多聚甲醛至各個孔，室溫孵育15-30 min后，去除固定液。

2.2. 每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室溫孵育5 min，中和殘留的固定液。

2.3. 以每孔0.1 mL 3% BSA in PBS的洗滌液洗滌細胞2次。

2.4. 去除洗滌液，加入0.1 mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每個孔中，室溫孵育20 min。

注意：本參考步驟是針對以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促滲操作樣本而優(yōu)化的操作方法，但本參考所介紹的步驟同樣可用于其他類似操作的樣本，如以甲醇固定以皂苷固定的樣本等。

3、EdU檢測

注：本參考步驟每孔反應(yīng)使用100μL的Click-iT反應(yīng)混合物。用戶可根據(jù)自己的樣本情況調(diào)整等比例減少所用的溶液體積。

3.1. 準備1× Click-iTEdU反應(yīng)緩沖液（組分C）：10×組分C試劑以去離子水稀釋10倍即可。

3.2. 制備一份5×的Click-iTEdU反應(yīng)添加物儲液（組分E）：加0.3 mL去離子水至30 mg的E組分試管中（100 mg/mL），混勻至全部溶解。使用后，剩余儲液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈現(xiàn)棕色，則說明有效成分降解不能再用（注意：不同規(guī)格的組分E均按照此比例加去離子水溶解為5×儲液備用）。

3.3. 準備1× Click-iTEdU緩沖液添加物：以去離子水稀釋5×儲液（組分E）至1×，溶液應(yīng)新鮮配置，當(dāng)天用完。

3.4. 依據(jù)表1準備Click-iT反應(yīng)混合物。表1要求添加的組分對于反應(yīng)來說非常重要，否則反應(yīng)無法有效進行。

表1 Click-iT反應(yīng)混合物

3.5. 去除促滲劑，以每孔0.1 mL的3% BSA in PBS的洗滌液洗滌2次，去除洗滌液。

3.6. 加入0.1 mL Click-iT反應(yīng)混合物至每個孔，簡短搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋細胞。

3.7. 室溫避光孵育30 min。

3.8. 除去反應(yīng)混合物，每孔以0.1 mL 3% BSA in PBS洗滌兩次，去除洗滌液。

對于核染色，可以進行DNA復(fù)染。如其他無特別要求，即可進行拍照分析。

4、DNA復(fù)染（可選）

4.1. 以0.1 mL PBS洗滌每孔1次，去掉洗滌液。

4.2. 以PBS稀釋Hoechst 33342（組分F）儲液1:2,000至1× Hoechst 33342溶液，終濃度為5 µg/mL。

4.3. 每孔加0.1 mL 1× Hoechst 33342溶液，室溫避光孵育15-30 min。除去Hoechst 33342溶液。

4.4. 0.1 mL PBS洗滌每孔2次，去除洗滌液。

HB220418