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大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)檢測試劑盒

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所  在  地上海

更新時(shí)間:2020-09-22 08:30:20瀏覽次數(shù):1085次

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應(yīng)用領(lǐng)域 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè) 主要用途 大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)檢測試劑盒用于體外定量分析大鼠血清、血漿
大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)檢測試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法,用于體外定量分析血清、血漿、尿液、細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGFβ1的含量。預(yù)先包被的抗體和檢測相抗體都是TGFβ1親和純化多克隆抗體。檢測相抗體經(jīng)生物素標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后,PBS或TBS洗滌。

大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)檢測試劑盒

本試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法,用于體外定量分析血清、血漿、尿液、細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGFβ1的含量。預(yù)先包被的抗體和檢測相抗體都是TGFβ1親和純化多克隆抗體。檢測相抗體經(jīng)生物素標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后,PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng);經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠TGFβ1呈正相關(guān)。

TGFβ1是一種氨基酸數(shù)目為112個(gè),分子量25KDa的二聚體蛋白質(zhì)。在各種屬間高度保守,例如大鼠和人、小鼠有*相同的氨基酸序列。幾乎所有細(xì)胞都有TGFβ1的受體,其對細(xì)胞的生長、分化的影響是非常廣泛的??傊?,間質(zhì)來源細(xì)胞受TGFβ1的刺激,而肝細(xì)胞、T、B淋巴細(xì)胞、角化上皮和很多內(nèi)皮細(xì)胞受TGFβ1的抑制作用。TGFβ1在很多組織的生長和分化過程中發(fā)揮著基礎(chǔ)性作用。本試劑盒所用標(biāo)準(zhǔn)品為重組TGFβ1,分子量25KDa。

檢測指標(biāo):TGF-β1;TGFβ1
檢測范圍:15.6pg/ml~1000pg/ml
特異性:系統(tǒng)和TGFβ2,TGFβ3,TGFβ5的交叉反應(yīng)<1%
敏感性:<1pg/ml

產(chǎn)品組成:

組分規(guī)格數(shù)量
預(yù)包被抗大鼠TGFβ1抗體的96孔板96T1板
重組大鼠TGFβ1標(biāo)準(zhǔn)品(凍干)10ng/管2管
生物素標(biāo)記抗大鼠TGFβ1(100X)130μl1管
親和素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)(100X)130μl1管
樣品稀釋液30ml1瓶
抗體稀釋液12ml1瓶
ABC稀釋液12ml1瓶
TMB顯色液10ml1瓶
TMB終止液10ml1瓶
洗滌緩沖液(25X)20ml1瓶
封板膜 4張



儲存條件:2-8℃(頻繁使用時(shí)),-20℃(長時(shí)間不用時(shí))
有效期: 6個(gè)月(4℃);12個(gè)月(-20℃)

參考標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù):(取自某一批次質(zhì)檢數(shù)據(jù),僅供參考,用戶需要自己建立標(biāo)準(zhǔn)曲線)

濃度(pg/ml)015.631.262.51252505001000
OD值0.0390.1080.1860.3210.5991.0171.5862.200
 

大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)檢測試劑盒原理:

問:同一樣品多次活性測試結(jié)果差異大怎么解決?

 

問:做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)每種要做幾個(gè)復(fù)孔呀?

 

答:預(yù)實(shí)驗(yàn)視情況而定,如果整個(gè)板子孔數(shù)較為充足,建議兩個(gè)復(fù)孔,如不充足,單孔也可以。要盡量保證實(shí)驗(yàn)過程中加樣準(zhǔn)確。

問:血清樣本少量溶血,顏色稍深,對結(jié)有影響嗎?

 

答:會有影響,建議取樣時(shí)需注意,避免溶血、脂血等樣本。如樣本條件受限,建議用樣本稀釋液適當(dāng)稀釋,減少基質(zhì)效應(yīng)影響。

問:試劑盒有推薦稀釋濃度還需要自己測嗎?

 

答:試劑盒一般會給出不同樣品的推薦稀釋比例,但是為大致范圍,還是根據(jù)自己的樣本情況,設(shè)計(jì)預(yù)實(shí)驗(yàn)測量計(jì)算。

問:加完終止液之后測的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大?

 

答:加完終止液后,顯色反應(yīng)也不是永遠(yuǎn)停止,形成的黃色顏色會隨著時(shí)間延長繼續(xù)加深,建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。

問:副孔差別比較大,是沒洗干凈嗎?

 

答:復(fù)孔值差異較大,主要原因應(yīng)考慮加樣是否準(zhǔn)確,洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。

問:配好的抗體沒用完如何保存,可保存多久?預(yù)實(shí)驗(yàn)用了一個(gè)試劑盒里面的部分板子和試劑,剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實(shí)驗(yàn)嗎?

 

答:一般來講,配好的母液,可以在四度保存,多一個(gè)月左右。剩下的板子和試劑是可以繼續(xù)用于正式實(shí)驗(yàn)的,間隔時(shí)間不要太長,一個(gè)月之內(nèi)均可,需注意試劑避免污染,板子保持干燥。

問:后顯示的OD值在多少之間屬于可用值,有要求嗎?

 

答:有的,建議標(biāo)準(zhǔn)曲線高濃度點(diǎn)的OD值在2.0左右較好,也可參考說明書標(biāo)曲的數(shù)據(jù)。

問:樣本總是在標(biāo)準(zhǔn)曲線之外,稀釋100倍也是,怎么辦?

 

答:在設(shè)置稀釋倍數(shù)之前,需要參考相關(guān)文獻(xiàn),對于一些表達(dá)*的蛋白,確實(shí)會出現(xiàn)這種情況,建議繼續(xù)提高稀釋比例。

問:試劑盒推薦用450和540nm雙波長檢測,但條件有限可否換成450和620的雙波長?如何使用校準(zhǔn)波長?還有,用空白孔校準(zhǔn)可以么?

 

答:可以的,TMB底物顯色后,吸光峰值在450nm,另外的校準(zhǔn)波長是防止氣泡等雜質(zhì)造成的干擾設(shè)置,避開450左右50nm以上即可。兩次讀取的OD值,用OD450 - OD校準(zhǔn)波長即可。盡量還是建議有條件的選用雙波長校準(zhǔn)的方法,因?yàn)楸苊饬瞬煌椎淖x數(shù)影響,防止出現(xiàn)空白孔污染,導(dǎo)致讀數(shù)較高,無法校準(zhǔn)的情況。

問:ELISA可以檢測胞內(nèi)蛋白么?

 

答:可以的,選用支持組織勻漿的ELISA試劑盒即可,將組織樣品或細(xì)胞樣品進(jìn)行裂解,提取胞內(nèi)蛋白后進(jìn)行蛋白定量,保證每孔上樣總蛋白量一致即可。

問:ELISA試劑盒顯色液是雙組份的,有些其他品牌的是單組分的,使用單組分的有影響么?

 

答:HRP酶標(biāo)二抗的ELISA試劑盒,顯色底物一般為TMB,TMB不穩(wěn)定,曝光或污染氧化后會出現(xiàn)顯色反應(yīng),導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)背景升高,或無法使用,所以愛必信的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份,方便穩(wěn)定保存,僅在使用前混合,避免了TMB的不穩(wěn)定影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液,在使用前檢測是否為無色透明,如果是正常的,對結(jié)果也沒有影響,可以放心使用。

問:整個(gè)過程需要避光嗎?避光需要避到什么程度呢?

 

答:ELISA實(shí)驗(yàn)中,在酶標(biāo)抗體孵育,以及顯色底物孵育這兩步建議避光,其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹,或?qū)⒄麄€(gè)ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。

問:標(biāo)準(zhǔn)曲線在推薦的濃度下,r值為0.9,做了多次都是這樣,怎么辦?

 

答:要仔細(xì)核對產(chǎn)品說明書,看是否用了推薦的擬合方法,如愛必信的ELISA試劑盒,需要使用四參數(shù)擬合方式進(jìn)行擬合,用錯(cuò)擬合方式,會導(dǎo)致r方值較低;如擬合方式無誤,需檢查是否有個(gè)別標(biāo)曲孔數(shù)值異常,排查實(shí)驗(yàn)中是否出現(xiàn)污染或倍比稀釋時(shí)出現(xiàn)失誤。

問:封板膜什么時(shí)候用?每次加液后都要換嗎?

 

答:封板膜在孵育樣品、檢測抗體以及HRP酶標(biāo)抗體是,都要蓋好封板膜,減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。

問:手動洗板過程中,拍過抗體或抗原的濾紙需要扔嗎?

 

答:是需要更換的,防止造成交叉污染,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

問:有的wash buffer析出結(jié)晶后在37℃也不溶解,怎么辦?

 

答:可提高至55度,并多次搖晃。溶解后按比例稀釋即可使用。

問:測得的值都低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的低值,是什么原因,應(yīng)該怎么解決?

 

答:原因較多,首先是檢查樣品是否稀釋倍數(shù)過高,降低稀釋比,直至直接加樣本原液,如還檢測不出,需排查原因,建議在實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置中添加陽性對照孔,用明確表達(dá)的樣品作為陽性對照,如果標(biāo)準(zhǔn)曲線及陽性樣品均可測得正常的表達(dá)濃度,則表明實(shí)驗(yàn)成功,其余待測樣品表達(dá)含量低于檢測下限,按照0計(jì)算即可。這種情況尤其對于炎癥因子較為常見,在健康樣本中,表達(dá)含量極低。

問:因?yàn)闄z測限的原因,同一塊ELISA板子,部分樣本稀釋,部分樣本1:10稀釋,部分1:20稀釋,這樣設(shè)置可行嗎?結(jié)果可以比較嗎?

 

答:可以比較,不同稀釋比例,是因?yàn)椴煌瑯颖鹃g的表達(dá)差異較大,只要保證稀釋后的檢測樣品測量值準(zhǔn)確,還原回稀釋倍數(shù)后的濃度是可信的??梢杂脕肀容^不同樣本的原始濃度差。

問:試劑盒里面有捕獲抗體么?

答:即用型ELISA試劑盒中,捕獲抗體已經(jīng)預(yù)包被至試劑盒中的ELISA板上,沒有單獨(dú)的捕獲抗體提供,直接使用ELISA板孵育稀釋后的樣本及標(biāo)準(zhǔn)品即可。

問:ELISA實(shí)驗(yàn)中,檢測計(jì)算抗原的濃度,臨界值怎么確定?

 

答:根據(jù)曲線測定的濃度,建議落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間位置較好,極限不要超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的上下限,如果超出較多,會影響計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確性,建議調(diào)整稀釋比例。

問:In vivo周期長的話,不太好做預(yù)實(shí)驗(yàn),怎么辦?

 

答:In vivo造模取樣后,可將樣品分裝,取一部分樣品做ELISA預(yù)實(shí)驗(yàn),剩余樣品再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn);如多批次實(shí)驗(yàn),操作較為一致,后續(xù)可取消預(yù)實(shí)驗(yàn),根據(jù)前期結(jié)果進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置。

問:做實(shí)驗(yàn)前怎么知道待測血清中炎癥因子的范圍呢?多大是高多小是低?

 

答:需要根據(jù)文獻(xiàn)推測,一般在健康人樣本中,炎癥因子表達(dá)很低,接近ELISA檢測下限,樣品無需稀釋或1:1稀釋即可,如已知為炎癥疾病或造模樣本,可參考文獻(xiàn),在預(yù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置1:10-100(或更高)的稀釋比例,預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測后確定佳濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

問:ELISA實(shí)驗(yàn)中的洗板步驟如果沒有洗板機(jī),需要如何操作?

 

答:實(shí)驗(yàn)室ELISA實(shí)驗(yàn)做的較多,還是建議使用洗板機(jī)洗板,效果更好,也更方便控制。如果沒有洗板機(jī),在洗板過程中,需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出,在加洗板液后,靜置1-2min,甩干液體后,在吸水紙上大力拍干;重復(fù)三次。

問:ELISA實(shí)驗(yàn)中,酶標(biāo)抗體識別的是哪個(gè)抗體?

 

答:在雙抗夾心法ELISA中,酶標(biāo)抗體識別的是檢測抗體,對檢測抗體進(jìn)行識別和酶標(biāo)記。

問:捕獲抗體如何包被在96孔板上?

 

答:如果選用的是即用型ELISA試劑盒,無需進(jìn)行抗體包被;如果是非即用型的ELISA試劑盒,首先,要選擇ELIS*別的板子,材質(zhì)應(yīng)為聚苯乙烯;然后用抗體包被液稀釋(pH9.6的碳酸鹽緩沖液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl)成工作濃度,然后每孔加100 μl稀釋后的捕獲抗體,室溫或4℃過夜包被,然后進(jìn)行洗板和封閉之后即可使用,如需長期保存,需要真空凍干后保存

問:ELISA實(shí)驗(yàn)中的捕獲抗體和檢測抗體是同一個(gè)抗體么?

 

答:不是的,在雙抗夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)中,會同時(shí)用到捕獲抗體和檢測抗體,這兩個(gè)抗體是針對同一抗原蛋白的不同抗原位點(diǎn)的兩種抗體,這樣才可以同時(shí)結(jié)合抗原分子。

問: ELISA可以測DNA的表觀么?

 

答:不可以,ELISA是利用免疫學(xué)原理,定量檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的技術(shù)。測DNA表觀遺傳學(xué),主要是檢測DNA甲基化,可以選用ChIP技術(shù)。

 

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