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當前位置:上海信裕生物科技有限公司>>ELISA試劑盒>>大鼠ELISA試劑盒>> 大鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)試劑盒
產(chǎn)品型號
品 牌其他品牌
廠商性質(zhì)生產(chǎn)商
所 在 地上海
更新時間:2020-09-21 11:16:54瀏覽次數(shù):1131次
聯(lián)系我時,請告知來自 化工儀器網(wǎng)純度 | 99.99% | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
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規(guī)格 | 96T/48T | 貨號 | XY0001H499 |
應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè) | 主要用途 | 大鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)檢測試劑盒用于體外定量分析大鼠血清、血漿 |
大鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)試劑盒
本試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法,用于體外定量分析大鼠血清、血漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量。預先包被的抗體為VEGF單克隆抗體。檢測相抗體為VEGF多克隆抗體,經(jīng)生物素標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后,PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應;經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的VEGF呈正相關。
VEGF是重要的血管生長因子之一。二個亞單位由二硫鍵連接,組成分子量46-48KDa的糖蛋白質(zhì)。VEGF有多個亞型。根據(jù)其亞單位所含氨基酸數(shù)量的不同,分別命名為VEGF121,VEGF144,VEGF165,VEGF189和VEGF206等。本試劑盒所用的標準品為重組大鼠VEGF164,有兩種分子量,單鏈25KDa,二聚體50KDa。
檢測指標:VEGF
檢測范圍:15.6pg/ml~1000pg/ml
特異性:系統(tǒng)和其它細胞因子無交叉反應
敏感性:<1pg/ml
產(chǎn)品組成:
組分 | 規(guī)格 | 數(shù)量 |
預包被抗大鼠VEGF抗體的96孔板 | 96T | 1板 |
重組大鼠VEGF標準品(凍干) | 10ng/管 | 2管 |
生物素標記抗大鼠VEGF(100X) | 130μl | 1管 |
親和素-過氧化物酶復合物(ABC)(100X) | 130μl | 1管 |
樣品稀釋液 | 30ml | 1瓶 |
抗體稀釋液 | 12ml | 1瓶 |
ABC稀釋液 | 12ml | 1瓶 |
TMB顯色液 | 10ml | 1瓶 |
TMB終止液 | 10ml | 1瓶 |
洗滌緩沖液(25X) | 20ml | 1瓶 |
封板膜 | 4張 |
儲存條件:2-8℃(頻繁使用時),-20℃(長時間不用時)
有效期: 6個月(4℃);12個月(-20℃)
參考標準曲線數(shù)據(jù):(取自某一批次質(zhì)檢數(shù)據(jù),僅供參考,用戶需要自己建立標準曲線)
濃度(pg/ml) | 0 | 15.6 | 31.2 | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 |
OD值 | 0.023 | 0.075 | 0.119 | 0.234 | 0.401 | 0.804 | 1.433 | 1.971 |
大鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)試劑盒原理:
問:同一樣品多次活性測試結果差異大怎么解決?
答:樣本保存不當,會導致多次實驗結果偏差較大,樣本應盡量減少反復凍融,如需多次檢測,需在取樣后分裝保存。
問:檢測樣本是細胞培養(yǎng)上清,那么細胞數(shù)目對炎癥因子的濃度有影響嗎?
答:有影響,所以不同樣本可以比較的前提條件是培養(yǎng)細胞數(shù)水平接近一致。
問:請問標曲是每次都要做嗎?
答:是的,每次實驗,孵育時間,洗板次數(shù)等等條件均不一樣,不同實驗的標曲不能混用,做一次實驗需要做一次標準曲線,并且用當次,同一塊板上的標準曲線結果去計算板內(nèi)樣品的濃度,才能得到準確的結果。
問:血清樣本少量溶血,顏色稍深,對結有影響嗎?
答:會有影響,建議取樣時需注意,避免溶血、脂血等樣本。如樣本條件受限,建議用樣本稀釋液適當稀釋,減少基質(zhì)效應影響。
問:試劑盒有推薦稀釋濃度還需要自己測嗎?
答:試劑盒一般會給出不同樣品的推薦稀釋比例,但是為大致范圍,還是根據(jù)自己的樣本情況,設計預實驗測量計算。
問:加完終止液之后測的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大?
答:加完終止液后,顯色反應也不是永遠停止,形成的黃色顏色會隨著時間延長繼續(xù)加深,建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。
問:副孔差別比較大,是沒洗干凈嗎?
答:復孔值差異較大,主要原因應考慮加樣是否準確,洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。
問:配好的抗體沒用完如何保存,可保存多久?預實驗用了一個試劑盒里面的部分板子和試劑,剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實驗嗎?
答:一般來講,配好的母液,可以在四度保存,多一個月左右。剩下的板子和試劑是可以繼續(xù)用于正式實驗的,間隔時間不要太長,一個月之內(nèi)均可,需注意試劑避免污染,板子保持干燥。
問:后顯示的OD值在多少之間屬于可用值,有要求嗎?
答:有的,建議標準曲線高濃度點的OD值在2.0左右較好,也可參考說明書標曲的數(shù)據(jù)。
問:樣本總是在標準曲線之外,稀釋100倍也是,怎么辦?
答:在設置稀釋倍數(shù)之前,需要參考相關文獻,對于一些表達*的蛋白,確實會出現(xiàn)這種情況,建議繼續(xù)提高稀釋比例。
問:試劑盒推薦用450和540nm雙波長檢測,但條件有限可否換成450和620的雙波長?如何使用校準波長?還有,用空白孔校準可以么?
答:可以的,TMB底物顯色后,吸光峰值在450nm,另外的校準波長是防止氣泡等雜質(zhì)造成的干擾設置,避開450左右50nm以上即可。兩次讀取的OD值,用OD450 - OD校準波長即可。盡量還是建議有條件的選用雙波長校準的方法,因為避免了不同孔的讀數(shù)影響,防止出現(xiàn)空白孔污染,導致讀數(shù)較高,無法校準的情況。
問:ELISA可以檢測胞內(nèi)蛋白么?
答:可以的,選用支持組織勻漿的ELISA試劑盒即可,將組織樣品或細胞樣品進行裂解,提取胞內(nèi)蛋白后進行蛋白定量,保證每孔上樣總蛋白量一致即可。
問:ELISA試劑盒顯色液是雙組份的,有些其他品牌的是單組分的,使用單組分的有影響么?
答:HRP酶標二抗的ELISA試劑盒,顯色底物一般為TMB,TMB不穩(wěn)定,曝光或污染氧化后會出現(xiàn)顯色反應,導致實驗背景升高,或無法使用,所以愛必信的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份,方便穩(wěn)定保存,僅在使用前混合,避免了TMB的不穩(wěn)定影響實驗結果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液,在使用前檢測是否為無色透明,如果是正常的,對結果也沒有影響,可以放心使用。
問:整個過程需要避光嗎?避光需要避到什么程度呢?
答:ELISA實驗中,在酶標抗體孵育,以及顯色底物孵育這兩步建議避光,其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹,或將整個ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。
問:標準曲線在推薦的濃度下,r值為0.9,做了多次都是這樣,怎么辦?
答:要仔細核對產(chǎn)品說明書,看是否用了推薦的擬合方法,如愛必信的ELISA試劑盒,需要使用四參數(shù)擬合方式進行擬合,用錯擬合方式,會導致r方值較低;如擬合方式無誤,需檢查是否有個別標曲孔數(shù)值異常,排查實驗中是否出現(xiàn)污染或倍比稀釋時出現(xiàn)失誤。
問:封板膜什么時候用?每次加液后都要換嗎?
答:封板膜在孵育樣品、檢測抗體以及HRP酶標抗體是,都要蓋好封板膜,減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。
問:手動洗板過程中,拍過抗體或抗原的濾紙需要扔嗎?
答:是需要更換的,防止造成交叉污染,影響實驗結果的準確性。
問:有的wash buffer析出結晶后在37℃也不溶解,怎么辦?
答:可提高至55度,并多次搖晃。溶解后按比例稀釋即可使用。
問:測得的值都低于標準曲線的低值,是什么原因,應該怎么解決?
答:原因較多,首先是檢查樣品是否稀釋倍數(shù)過高,降低稀釋比,直至直接加樣本原液,如還檢測不出,需排查原因,建議在實驗組別設置中添加陽性對照孔,用明確表達的樣品作為陽性對照,如果標準曲線及陽性樣品均可測得正常的表達濃度,則表明實驗成功,其余待測樣品表達含量低于檢測下限,按照0計算即可。這種情況尤其對于炎癥因子較為常見,在健康樣本中,表達含量極低。
問:因為檢測限的原因,同一塊ELISA板子,部分樣本稀釋,部分樣本1:10稀釋,部分1:20稀釋,這樣設置可行嗎?結果可以比較嗎?
答:可以比較,不同稀釋比例,是因為不同樣本間的表達差異較大,只要保證稀釋后的檢測樣品測量值準確,還原回稀釋倍數(shù)后的濃度是可信的??梢杂脕肀容^不同樣本的原始濃度差。
問:試劑盒里面有捕獲抗體么?
答:即用型ELISA試劑盒中,捕獲抗體已經(jīng)預包被至試劑盒中的ELISA板上,沒有單獨的捕獲抗體提供,直接使用ELISA板孵育稀釋后的樣本及標準品即可。
問:ELISA實驗中,檢測計算抗原的濃度,臨界值怎么確定?
答:根據(jù)曲線測定的濃度,建議落在標準曲線的中間位置較好,極限不要超過標準曲線的上下限,如果超出較多,會影響計算結果準確性,建議調(diào)整稀釋比例。
問:In vivo周期長的話,不太好做預實驗,怎么辦?
答:In vivo造模取樣后,可將樣品分裝,取一部分樣品做ELISA預實驗,剩余樣品再進行正式實驗;如多批次實驗,操作較為一致,后續(xù)可取消預實驗,根據(jù)前期結果進行ELISA實驗濃度設置。
問:做實驗前怎么知道待測血清中炎癥因子的范圍呢?多大是高多小是低?
答:需要根據(jù)文獻推測,一般在健康人樣本中,炎癥因子表達很低,接近ELISA檢測下限,樣品無需稀釋或1:1稀釋即可,如已知為炎癥疾病或造模樣本,可參考文獻,在預實驗中設置1:10-100(或更高)的稀釋比例,預實驗檢測后確定佳濃度進行正式實驗。
問:ELISA實驗中的洗板步驟如果沒有洗板機,需要如何操作?
答:實驗室ELISA實驗做的較多,還是建議使用洗板機洗板,效果更好,也更方便控制。如果沒有洗板機,在洗板過程中,需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出,在加洗板液后,靜置1-2min,甩干液體后,在吸水紙上大力拍干;重復三次。
問:ELISA實驗中,酶標抗體識別的是哪個抗體?
答:在雙抗夾心法ELISA中,酶標抗體識別的是檢測抗體,對檢測抗體進行識別和酶標記。
問:捕獲抗體如何包被在96孔板上?
答:如果選用的是即用型ELISA試劑盒,無需進行抗體包被;如果是非即用型的ELISA試劑盒,首先,要選擇ELIS*別的板子,材質(zhì)應為聚苯乙烯;然后用抗體包被液稀釋(pH9.6的碳酸鹽緩沖液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl)成工作濃度,然后每孔加100 μl稀釋后的捕獲抗體,室溫或4℃過夜包被,然后進行洗板和封閉之后即可使用,如需長期保存,需要真空凍干后保存
問:ELISA實驗中的捕獲抗體和檢測抗體是同一個抗體么?
答:不是的,在雙抗夾心法ELISA實驗中,會同時用到捕獲抗體和檢測抗體,這兩個抗體是針對同一抗原蛋白的不同抗原位點的兩種抗體,這樣才可以同時結合抗原分子。
問: ELISA可以測DNA的表觀么?
答:不可以,ELISA是利用免疫學原理,定量檢測蛋白質(zhì)表達的技術。測DNA表觀遺傳學,主要是檢測DNA甲基化,可以選用ChIP技術。
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