UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝

UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝
與常規(guī)的非變性細(xì)胞裂解緩沖液（RIPA buffer, 1% Triton X-100等）相比，這款緩沖液套裝（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相對(duì)困難的脂筏（Lipid Raft）蛋白質(zhì)。從常規(guī)緩沖液中不可溶而丟棄的膜組分中，在維持蛋白質(zhì)功能的情況下能實(shí)現(xiàn)高效地提取，有利于對(duì)脂筏等蛋白質(zhì)的功能分析。

UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝

大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代RIPA緩沖液

 

 

　　與常規(guī)的非變性細(xì)胞裂解緩沖液（RIPA buffer, 1% Triton X-100等）相比，這款緩沖液套裝（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相對(duì)困難的脂筏（Lipid Raft）蛋白質(zhì)。從常規(guī)緩沖液中不可溶而丟棄的膜組分中，在維持蛋白質(zhì)功能的情況下能實(shí)現(xiàn)高效地提取，有利于對(duì)脂筏等蛋白質(zhì)的功能分析。

　　※本產(chǎn)品僅限于研究用。不可用于臨床治療。

 

 

◆細(xì)胞膜上的不溶性成分——脂筏（Lipid Raft）

 

　　裂解細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分析的時(shí)候，經(jīng)常會(huì)使用RIPA （Radio-Immuno Precipitation Assay）緩沖液和1% Triton X-100緩沖液等的相對(duì)溫和的細(xì)胞膜裂解緩沖液。這些緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)造和功能的影響小，適用于酶活性試驗(yàn)、免疫沉降和各種結(jié)合實(shí)驗(yàn)等蛋白質(zhì)的功能分析。另一方面，與具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用的SDS緩沖液相比，增溶能力較弱，*不能溶解以脂筏（Lipid Raft）為主的細(xì)胞膜組分。許多表面活性劑都不能溶解脂筏，故其又被稱為Detergent Resistant Membrane (DRM）。DRM中所含蛋白質(zhì)的功能分析被認(rèn)為是十分困難的。

 

 

　　脂筏（Lipid Raft）是由膽固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI錨定蛋白（GPI anchor protein）和棕櫚?；╬almitoylation）蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞膜構(gòu)造，被認(rèn)為是整合各種功能蛋白的功能域。神經(jīng)細(xì)胞突觸和免疫細(xì)胞的免疫突觸是脂筏的代表性例子。

 

脂筏示意圖

 

 

◆特點(diǎn)

 

●	操作簡(jiǎn)單，能快速提取脂筏蛋白
●	使用兩種類型的緩沖液（A buffer，B buffer）進(jìn)行兩個(gè)階段的提取。先提取出胞漿蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白
●	Buffer提取的任何蛋白質(zhì)都不會(huì)失活
●	A buffer和一般的RIPA buffer成分相同＊。B buffer含有表面活性劑，可以通過(guò)透析除去
●	適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞/組織
●	使用本品配制的溶解液適用于酶活性試驗(yàn)、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA法）、SDS-PAGE和Western blot等
＊	1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium  Deoxycholate

 

 

◆緩沖液套裝組成

 

　　●　A buffer (RIPA buffer) （100 mL）

　　●　B buffer（10 mL）

 

 

◆使用方法

 

1、	用A buffer溶解組織或培養(yǎng)細(xì)胞。
※	為了提高溶解效率，推薦使用均質(zhì)或超聲波破碎設(shè)備。
2、	進(jìn)行離心分離，使A buffer中可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀）分離，分別回收。上層清液A  buffer可溶性組分中主要含有胞漿蛋白和非脂筏蛋白。
3、	往沉淀的A buffer 不溶性組分中加入B buffer，形成懸濁液。
4、	進(jìn)行離心分離，與步驟2一樣分離出可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀），分別回收。上層清液的B buffer可溶性組分中含有脂筏蛋白。
5、	可應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)。
※	A buffer和B buffer不可用于Bradford法蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)定量請(qǐng)使用BCA檢測(cè)。
※	使用本品A buffer和B buffer進(jìn)行兩個(gè)階段的提取是最適宜的，也有只對(duì)細(xì)胞使用B buffer進(jìn)行溶解和提取的例子。具體請(qǐng)參照以下例子。

 

 

 

UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比較

	蛋白分離			蛋白結(jié)構(gòu)	蛋白功能	應(yīng)用
	胞質(zhì)蛋白	膜蛋白
		非脂筏蛋白	脂筏蛋白
＞1%SDS buffer	○	○	○	╳	╳	SDS-PAGE
RIPA buffer	○	○	╳	○	○	酶分析法測(cè)定 免疫沉淀 SDS-PAGE等
UltraRIPA	○	○	○	○	○

 

 

◆應(yīng)用例

 

從脂筏中提取總蛋白

 

　　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer進(jìn)行提取。提取后的總蛋白用SDS-PAGE/銀染色檢測(cè)（左），用BCA法定量蛋白質(zhì)（右）。相對(duì)于具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用的2% SDS緩沖液，UltraRIPA kit能夠提取70%以上的蛋白質(zhì)。

　　※不能保證全部蛋白質(zhì)的可溶性都得到改善。

 

 

脂筏標(biāo)記蛋白的提取

 

　　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer，提取后進(jìn)行SDS-PAGE。利用對(duì)應(yīng)脂筏標(biāo)記蛋白的抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

 

 

 

脂筏標(biāo)記蛋白的免疫沉淀

 

　　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分，通過(guò)B buffer提取脂筏標(biāo)記蛋白。對(duì) buffer提取物使用脂筏標(biāo)記蛋白PSD95的抗體和G蛋白偶聯(lián)磁珠進(jìn)行免疫沉淀。使用銀染色和抗PSD95抗體通過(guò)Western blot檢測(cè)進(jìn)行確認(rèn)。

 

 

 

提取的蛋白質(zhì)的酶活性測(cè)定

 

　　用1%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和2%SDS溶解CHO細(xì)胞，測(cè)定溶解物中乳酸脫氫酶（LDH）的活性。2%SDS具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用，在幾乎*失活的情況下，1% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和UltraRIPA kit B buffer所得的酶活性大致相同。

 

 

 

從脂筏中提取功能蛋白

 

　　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分。用A buffer分三次沖洗不溶性組分，消除RIPA可溶性組分中脫磷酸酶的活性。往不溶性組分中分別添加2% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和B buffer，測(cè)定各種提取物的總脫磷酸化酶活性。下圖是各緩沖液從RIPA不溶性組分中提取的蛋白質(zhì)的量（左軸：黑）和所檢測(cè)的脫磷酸酶的活性（右軸：紅）的示意圖。2% SDS buffer能夠從RIPA不溶性組分中很好地提取蛋白質(zhì)，但容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，*失去脫磷酸化活性。RIPA buffer不能提取蛋白質(zhì)，活性也無(wú)法檢測(cè)。UltraRIPA kit B buffer所提取的蛋白質(zhì)大約為2% SDS buffer的70%，且可以檢測(cè)出較強(qiáng)的脫磷酸化活性。

 

UltraRIPA kit B buffer單獨(dú)提取脂筏蛋白的可能性評(píng)價(jià)

※數(shù)據(jù)提供：東京大學(xué)藥學(xué)院研究生院保健化學(xué)系

 

　　用PBS沖洗COS-1細(xì)胞，分別使用SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和UltraRIPA kit B buffer裂解，通過(guò)離心分離（14,000 rpm, 5 min,4℃）可溶性組分和不可溶性組分。不可溶性組分用等量的SDS-PAGE樣品緩沖液變性溶解。脂筏標(biāo)記Flotilin1的可溶部分通過(guò)SDS-PAGE/western blot測(cè)定。使用1% Triton X-100和RIPA buffer，大部分的Flotilin 1不溶性膜組分沒(méi)有被溶解，而UltraRIPA kit B buffer幾乎可以全部溶解。

 

 

 

◆各buffer組成

 

●	SDS buffer（2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）
●	UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl， 0.5％ Sodium Deoxycholate)
●	UltraRIPA kit B buffer (成分保密)
●	1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）

 

 

◆產(chǎn)品列表

 

產(chǎn)品列表	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
F015	UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝	1kit

 

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