qPCR結(jié)果都不一樣？這些技巧你需要掌握！

做過qPCR（熒光定量PCR）的小伙伴，可能會(huì)遇到這樣的問題，明明已經(jīng)按照文獻(xiàn)的方法，照搬PCR引物，可還是每次結(jié)果都不一樣。

其實(shí)原因有這么幾個(gè)：

有些小伙伴可能會(huì)說，移液槍使用多么簡單，怎么可能不會(huì)用？實(shí)際上，在使用移液槍，特別是微量移液槍的時(shí)候，我們往往會(huì)長期快速操作，也就是說在彈簧還沒來得及恢復(fù)的時(shí)候，我們已經(jīng)又按了一下了。這樣可能導(dǎo)致的結(jié)果不用我多說，首先可能會(huì)導(dǎo)致……指關(guān)節(jié)受傷。當(dāng)然，這些只是其次，最重要的是會(huì)影響移液量。

所以，關(guān)愛拇指，吸取液體時(shí)，保持1-2秒，給彈簧一個(gè)緩沖。當(dāng)然，在加模板的時(shí)候，提高模板加樣量，也可以盡可能減少每次加樣的誤差。

吸取液體的時(shí)候，需要把槍頭插入凹液面底部，而不是插到凹液面的側(cè)面。側(cè)面比較容易產(chǎn)生氣泡：

當(dāng)然，你會(huì)說，每次槍頭都插很深（莫名其妙覺得是在開車），但是這樣的話，就很容易在槍頭上沾上液滴，在微量的模板加樣時(shí)，很容易導(dǎo)致加樣量的誤差。

二、RNA的降解，也就是RNA完整性的問題  

RNA的完整性，一般體現(xiàn)在電泳過程中18S和28S的亮度上，如果這兩個(gè)條帶的RNA亮度變低，甚至沒有，就說明RNA的完整性應(yīng)該會(huì)有損失。（但實(shí)際上現(xiàn)在沒人去跑電泳）導(dǎo)致RNA完整性受損的原因有很多，比如：

包括鎂離子，pH，溫度，紫外線，福爾馬林等等都會(huì)對(duì)你的RNA產(chǎn)生影響。所以，要處處小心。于是有人做了這樣的實(shí)驗(yàn)，就是對(duì)于RNA的降解，有沒有什么方法可以降低RNA降解對(duì)于qPCR的影響。

他們分別分析了3`端和5`端的擴(kuò)增CT值，以及長片段和短片段的ΔCT，發(fā)現(xiàn)RNA的完整性缺失與3`端和5`端沒多大關(guān)系，但是短片段會(huì)比長片段擴(kuò)增效率更高。所以，qPCR引物設(shè)計(jì)的過程中，盡量把片段設(shè)計(jì)得短一點(diǎn)。

三、抑制物，這點(diǎn)相對(duì)難解決               

在反轉(zhuǎn)錄過程中或者PCR過程中都可能有抑制物，這些抑制物，比如Na離子，EDTA，SDS，酚，血紅素，腐植酸等等，都會(huì)對(duì)qPCR結(jié)果產(chǎn)生影響。具體體現(xiàn)在擴(kuò)增曲線里會(huì)是這樣：

實(shí)際上去除抑制劑也只能在抽提的過程中盡量洗脫掉抑制劑，別的操作過程中其實(shí)也沒什么辦法（加促進(jìn)劑可能又會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定因素）。

我們往往謹(jǐn)慎對(duì)待：引物、探針、Ct 值等，但也有一些小東西會(huì)被忽視，比如：ROX™。也許很多同學(xué)的第一反應(yīng)是：總聽人說起 ROX™，但它是什么？它在熒光定量 PCR 里起到什么作用呢？

其實(shí)和 FAM™、VIC™、SYBR™ Green 類似，ROX™ 也是一種在 qPCR 反應(yīng)中能被 qPCR 儀檢測到的熒光染料分子。但與其他染料不同，ROX™ 是一種惰性參比染料，也就是說，其熒光信號(hào)并不隨著 PCR 擴(kuò)增而增強(qiáng)。相反，ROX™ 的熒光信號(hào)值在反應(yīng)中是基本保持不變的。

四、ROXTM  有什么問呢？             

其實(shí)，在 qPCR 反應(yīng)中有許多反應(yīng)本身的物理因素會(huì)影響信號(hào)檢測，從而造成孔間數(shù)據(jù)的差異。例如：PCR 反應(yīng)板本底信號(hào)不均一，PCR 管蓋厚度有差異，同一反應(yīng)體系在分裝時(shí)出現(xiàn)了差異等因素。ROX™ 能幫助我們通過均一化校正消除這些因素的誤差，從而提高數(shù)據(jù)精確性。

五、ROXTM  的工作原理？             

請大家注意看板上的兩個(gè)孔，我們在每個(gè)孔中加入「wan全等量」的樣本，然后進(jìn)行擴(kuò)增。很快，30 個(gè)循環(huán)完成了。在每一個(gè)循環(huán)中，我們的儀器都會(huì)讀取出一個(gè)熒光信號(hào)值。

理論上儀器檢測出這兩個(gè)孔的信號(hào)值應(yīng)該是wan全相同的，因?yàn)閯傞_始的時(shí)候樣品是wan全一樣的。但實(shí)際上，由于移液器加樣存在誤差，耗材孔間不同等一系列差異，這兩孔檢測出的信號(hào)值并不相同。幸運(yùn)的是，我們在兩個(gè)孔中都加了相同的 ROX™，而我們的儀器也同時(shí)讀取了 ROX™ 的信號(hào)值。

可以看到，ROX™ 信號(hào)和 qPCR 反應(yīng)熒光信號(hào)都有差異。仔細(xì)思考大家會(huì)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)本身的這些物理差異會(huì)對(duì) ROX™ 信號(hào)和 qPCR 反應(yīng)的熒光信號(hào)造成同等程度的影響。

重要的是，我們的儀器會(huì)在每一個(gè)循環(huán)中檢測每一個(gè)反應(yīng)孔的這兩種信號(hào)，然后在反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)進(jìn)行均一化處理。結(jié)合儀器自身的一系列熒光校準(zhǔn)參數(shù)，最終您的數(shù)據(jù)精度會(huì)得到顯著提高。順便提一下，最終這個(gè)值也就是我們所說的 Rn 值，也表示報(bào)告基團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光值。

六、兩個(gè)關(guān)于ROXTM  的重點(diǎn)：          

第一，除非有些特殊情況，Applied Biosystems™ 提供給您的熒光定量預(yù)混液已經(jīng)包含了最佳濃度的 ROX™，因此您無需再額外添加。

第二，所有 Applied Biosystems™ 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 軟件是默認(rèn)檢測 ROX™ 并使用均一化數(shù)據(jù)，這會(huì)幫您提高數(shù)據(jù)精確性。如果您選用的試劑盒或者預(yù)混液不含 ROX™，依據(jù)您對(duì)實(shí)驗(yàn)的精度的要求不同，您可以另外采購 ROX™ 摸索最佳濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，您也可以將參比熒光染料選項(xiàng)改為 None（無），放棄 ROX 校正。在沒有 ROX™ 存在的情況下，我們建議選擇參比熒光為 None 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

好了，看看你的操作過程中是不是有這樣或者那樣的問題，看看你的擴(kuò)增曲線是不是有比較奇怪的變化，然后，進(jìn)行改進(jìn)吧。