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BCA蛋白定量試劑盒

Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination

BSA標(biāo)準(zhǔn)品為5 mg/ml BSA，溶于水中，含0.05%疊氮鈉。

室溫運(yùn)輸和儲(chǔ)存。如因溫度低或長(zhǎng)時(shí)間放置出現(xiàn)沉淀，將其搖勻即可使用。BSA標(biāo)準(zhǔn)品保存在-20度，如出現(xiàn)微生物污染則應(yīng)丟棄。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

BCA蛋白定量試劑盒是一種基于二喹啉甲酸比色法的總蛋白檢測(cè)和定量試劑盒，比Lowry法更為*。BCA蛋白定量法以快速靈敏、穩(wěn)定可靠且對(duì)不同種類蛋白質(zhì)變異系數(shù)甚小而深受專業(yè)人士的青睞，樣品中離子型和非離子型去污劑對(duì)其影響較小，檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)。BCA法的原理：在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子，二喹啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成紫色的絡(luò)合物，這種絡(luò)合物溶于水并在562 nm處產(chǎn)生光吸收峰值，光吸收強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量呈近似線性關(guān)系，因此使用比色法可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和定量。BCA法沒(méi)有反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間而持續(xù)進(jìn)行；通過(guò)一段時(shí)間的孵育后，反應(yīng)速度會(huì)變慢，從而可以對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)。

在蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu)中，與BCA反應(yīng)顏色形成相關(guān)的是肽鍵和四種氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸，色氨酸，以及酪氨酸）。對(duì)二肽、三肽和四肽的研究表明，反應(yīng)顏色的形成不僅僅是單個(gè)的功能基團(tuán)效果疊加的結(jié)果。因此，蛋白濃度通常是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照蛋白（常用牛血清白蛋白BSA）推測(cè)而來(lái)的，即：將標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照蛋白的光吸收值做一個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知樣品的光吸收值參照曲線方程計(jì)算出蛋白濃度值。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白和工作液的配制

1. 配制牛血清白蛋白梯度：可根據(jù)檢測(cè)范圍和預(yù)估的樣品蛋白濃度來(lái)配制BSA濃度梯度，使用與待測(cè)樣品相同的溶劑。可按比例放大或縮小，根據(jù)實(shí)際需要計(jì)算所需用量。

B.       BCA工作液的配制

1.        根據(jù)需要測(cè)定的未知樣品和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量以及復(fù)孔數(shù)來(lái)計(jì)算所需的BCA工作液體積。如使用試管進(jìn)行測(cè)試，每管需2.0 ml工作液, 而使用96孔板進(jìn)行測(cè)試則每孔需200 µl 工作液。

2.        按 組份A:組份B=50:1 的比例配制BCA工作液。組份B加入組份A的時(shí)候，開(kāi)始會(huì)出現(xiàn)渾濁并隨著混勻很快消失，zui終混勻后溶液呈蘋果綠色。配置好的工作液在室溫密閉的條件下24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

操作步驟

1.        如在試管中進(jìn)行反應(yīng)，取100 μl的BSA蛋白梯度或者待測(cè)樣品，放入標(biāo)記好的試管中，再每管加入2.0 ml工作液，充分混勻， 蓋上蓋子，并在選定的溫度條件下孵育：

·          室溫:                             室溫孵育 2 hours (檢測(cè)范圍： 20-2000 μg/ml)

·          37度:                            37°C 孵育30 minutes (檢測(cè)范圍： 20-2000 μg/ml)

·          60度：               60°C 孵育30 minutes (檢測(cè)范圍： 5-250 μg/ml)

延長(zhǎng)孵育時(shí)間會(huì)增加光吸收值；應(yīng)使用水浴法加熱，以使得溫度均衡上升；用鼓風(fēng)法升溫會(huì)導(dǎo)致溫度不均衡，使實(shí)驗(yàn)誤差增大。

2.        如需在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，則每孔放入10 μl的BSA蛋白梯度或者待測(cè)樣品，再加入200 μl工作液，充分混勻，37度孵育30分鐘，檢測(cè)范圍為125-2000 μg/ml；也可以將BSA蛋白梯度和待測(cè)樣品提高到每孔25 μl，再加入200 μl工作液，充分混勻，37度孵育30分鐘，此時(shí)檢測(cè)范圍為20-2000 μg/ml，但是可能會(huì)較多受到樣品中的干擾物質(zhì)的干擾；應(yīng)使用水浴法加熱。

3.        將試管或96孔板冷卻至室溫。

4.        用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀在562 nm處讀取光吸收值, 所有樣品應(yīng)在10分鐘內(nèi)讀完。因?yàn)?/span>BCA反應(yīng)沒(méi)有終點(diǎn)，隨著時(shí)間的推移光吸收值會(huì)繼續(xù)上升，在10分鐘內(nèi)讀完所有樣品可以避免產(chǎn)生明顯的誤差。

5.        將BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的光吸收值減去空白對(duì)照值，以得到的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品光吸收值對(duì)蛋白濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)這個(gè)曲線方程計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白濃度。

注意事項(xiàng)：

·          測(cè)定蛋白濃度時(shí)，使未知樣品的蛋白濃度處于標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線的接近中間位置，這樣獲得的結(jié)果更準(zhǔn)確。

·          通過(guò)增加孵育時(shí)間或者提高樣品比例，可以提高光吸收值，從而檢測(cè)更低的蛋白量，但是會(huì)縮小檢測(cè)范圍，可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整，同時(shí)注意不要超過(guò)儀器的檢測(cè)上限。

·          zui適檢測(cè)波長(zhǎng)為562 nm。在540 nm到590 nm區(qū)間也可進(jìn)行檢測(cè), 但標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和檢測(cè)靈敏度都會(huì)有所降低。

·          酶標(biāo)儀的檢測(cè)光徑比分光光度計(jì)的比色杯短，因而檢測(cè)靈敏度有所降低。

·          對(duì)酶標(biāo)儀的讀數(shù)進(jìn)行曲線擬合時(shí)， 采用four-parameter (quadratic) 或 best-fit curve 進(jìn)行擬合可以獲得比線性擬合更準(zhǔn)確的結(jié)果；手工擬合時(shí)可采用線性擬合法。

·          EDTA濃度必須小于10 mM，不兼容EGTA。不適用BCA法時(shí)，請(qǐng)使用Bradford蛋白濃度測(cè)定法。

·          每種常用的總蛋白測(cè)定方法測(cè)定不同的蛋白時(shí)都有一些偏差。導(dǎo)致產(chǎn)生這些偏差的原因有：蛋白質(zhì)的氨基酸序列，等電點(diǎn)，蛋白的結(jié)構(gòu)，特定種類的氨基酸側(cè)鏈和輔基。有些種類的氨基酸側(cè)鏈和輔基能對(duì)顯色反應(yīng)產(chǎn)生很大的影響。大部分蛋白測(cè)定方法都使用牛血清白蛋白（BSA）或免疫球蛋白(IgG)作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果需要特別精確的檢測(cè)結(jié)果，可以使用待測(cè)蛋白的純品來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

·          一些物質(zhì)可以干擾BCA反應(yīng)，如還原劑、絡(luò)合劑，以及強(qiáng)酸和強(qiáng)堿。還有一些物質(zhì)干擾較小，只要不超過(guò)最大兼容濃度即不影響反應(yīng)的進(jìn)行。

·          本產(chǎn)品*于專業(yè)人員的科學(xué)研究用。

·          為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

常見(jiàn)問(wèn)題