增強型BCA蛋白定量試劑盒

Enhanced Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination

BSA標準品為5 mg/ml BSA，溶于水中，含0.05%疊azide氮鈉。

室溫運輸和儲存。如因溫度低或長時間放置出現(xiàn)沉淀，將其搖勻即可使用。BSA標準品保存在-20度，如出現(xiàn)微生物污染則應丟棄。

產品簡介

BCA蛋白定量試劑盒是一種基于二喹quinoline啉甲酸比色法的總蛋白檢測和定量試劑盒，比Lowry法更為*。BCA蛋白定量法以快速靈敏、穩(wěn)定可靠且對不同種類蛋白質變異系數(shù)甚小而深受專業(yè)人士的青睞，樣品中離子型和非離子型去污劑對其影響較小，檢測不同蛋白質分子的變異系數(shù)遠小于考馬斯亮藍。BCA法的原理：在堿性環(huán)境下，蛋白質將銅離子還原成亞銅離子，二喹quinoline啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成紫色的絡合物，這種絡合物溶于水并在562 nm處產生光吸收峰值，光吸收強度在一定范圍內與蛋白質含量呈近似線性關系，因此使用比色法可以對蛋白質進行檢測和定量。BCA法沒有反應終點，反應會隨著時間而持續(xù)進行；通過一段時間的孵育后，反應速度會變慢，從而可以對大量樣品進行檢測。

在蛋白質的大分子結構中，與BCA反應顏色形成相關的是肽鍵和四種氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸，色氨酸，以及酪氨酸）。對二肽、三肽和四肽的研究表明，反應顏色的形成不僅僅是單個的功能基團效果疊加的結果。因此，蛋白濃度通常是根據(jù)標準對照蛋白（常用牛血清白蛋白BSA）推測而來的，即：將標準對照蛋白的光吸收值做一個濃度梯度標準曲線，未知樣品的光吸收值參照曲線方程計算出蛋白濃度值。

增強型BCA蛋白定量試劑盒采用了濃縮型試劑配方，提高了孵育時間和溫度，因此可以增加樣品體積和增加光吸收值，從而能夠檢測更低濃度的蛋白，檢測范圍可低至0.5到20 μg/ml。

標準蛋白和工作液的配制

配制牛血清白蛋白梯度：可根據(jù)檢測范圍和預估的蛋白濃度來配制BSA濃度梯度，最好使用與待測樣品相同的溶劑?？砂幢壤糯蠡蚩s小，根據(jù)實際需要計算所需用量。

BCA工作液的配制

根據(jù)需要測定的未知樣品和蛋白標準品的數(shù)量以及復孔數(shù)來計算所需的BCA工作液體積。如使用試管進行測試，每管需1.0 mL工作液, 而使用96孔板進行測試則每孔需150 µl 工作液。

按 組份A:組份B:組份C = 25:24:1 的比例配制BCA工作液。組份C加入組份A+B的時候，開始會出現(xiàn)渾濁并隨著混勻很快消失，最終混勻后溶液呈蘋果綠色。配置好的工作液在室溫密閉的條件下24小時內穩(wěn)定。

操作步驟

如在試管中進行反應，取1.0 ml的BSA蛋白梯度或者待測樣品，放入標記好的試管中，再每管加入1.0 ml 工作液，充分混勻， 蓋上蓋子，并在60°C 孵育60 minutes, 檢測范圍： 0.5-20 μg/ml。

延長孵育時間會增加光吸收值；應使用水浴法加熱，以使得溫度均衡上升；用鼓風法升溫會導致溫度不均衡，使實驗誤差增大。

如需在96孔板中進行反應，則每孔放入150 μl的BSA蛋白梯度或者待測樣品，再加入150 μl工作液，充分混勻，37度孵育120分鐘，檢測范圍為2-40 μg/ml；注意溫度不要高于37度，否則會出現(xiàn)背景升高和反應異常，大多數(shù)聚苯乙烯（polystyrene）微孔板會在60度出現(xiàn)霧化現(xiàn)象；應使用水浴法加熱。

將試管或96孔板冷卻至室溫。

用分光光度計或酶標儀在562 nm處讀取光吸收值, 所有樣品應在10分鐘內讀完。因為BCA反應沒有終點，隨著時間的推移光吸收值會繼續(xù)上升，在10分鐘內讀完所有樣品可以避免產生明顯的誤差。

將BSA蛋白標準品和待測樣品的光吸收值減去空白對照值，以得到的蛋白標準品光吸收值對蛋白濃度作標準曲線，根據(jù)這個曲線方程計算待測樣品的蛋白濃度。

注意事項：

測定蛋白濃度時，最好使未知樣品的蛋白濃度處于標準擬合曲線的接近中間位置，這樣獲得的結果更準確。

通過增加孵育時間或者提高樣品比例，可以提高光吸收值，從而檢測更低的蛋白量，但是會縮小檢測范圍，可根據(jù)實際需要進行調整，同時注意不要超過儀器的檢測上限。

最適檢測波長為562 nm。在540 nm到590 nm區(qū)間也可進行檢測, 但標準曲線斜率和檢測靈敏度都會有所降低。

酶標儀的檢測光徑比分光光度計的比色杯短，因而檢測靈敏度有所降低。

用軟件對酶標儀的讀數(shù)進行曲線擬合時，采用best-fit polynomial equation進行擬合可以獲得比線性擬合更準確的結果；手工擬合時可采用線性擬合法。

EDTA濃度必須小于0.5 mM，不兼容EGTA。不適用BCA法時，請使用Bradford蛋白濃度測定法。

每種常用的總蛋白測定方法測定不同的蛋白時都有一些偏差。導致產生這些偏差的原因有：蛋白質的氨基酸序列，等電點，蛋白的結構，特定種類的氨基酸側鏈和輔基。有些種類的氨基酸側鏈和輔基能對顯色反應產生很大的影響。大部分蛋白測定方法都使用牛血清白蛋白（BSA）或免疫球蛋白(IgG)作為標準品來制作標準曲線。如果需要特別精確的檢測結果，可以使用待測蛋白的純品來制作標準曲線。

一些物質可以干擾BCA反應，如還原劑、絡合劑，以及強酸和強堿。還有一些物質干擾較小，只要不超過最大兼容濃度即不影響反應的進行。

本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常見問題

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