簡(jiǎn)介

神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)許多化合物、環(huán)境因素和某些天然物質(zhì)的毒性作用非常敏感。在脊髓損傷、卒中或創(chuàng)傷性腦損傷等病理過(guò)程中，神經(jīng)毒性可導(dǎo)致大腦或周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷。它也是阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)主要因素。

使用人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSCs) 進(jìn)行高內(nèi)涵成像可用于檢查候選藥品或環(huán)境污染物的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)毒性作用。本說(shuō)明展示了使用 iPSCs 和 Molecular Devices 系統(tǒng)和軟件通過(guò)自動(dòng)化終點(diǎn)和活細(xì)胞檢測(cè)進(jìn)行神經(jīng)元毒性篩選。

優(yōu)勢(shì)

•   通過(guò)真正自動(dòng)化的采集和分析進(jìn)行設(shè)置且無(wú)人值守

•    即時(shí)量化每個(gè)神經(jīng)元的多個(gè)表型特征

•    監(jiān)測(cè)活細(xì)胞數(shù)分鐘或數(shù)天的實(shí)時(shí)毒性

基于iPSC 的毒性篩選

iPSC 對(duì)神經(jīng)元毒性研究非常有用，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出成熟神經(jīng)元的功能和行為，并且可用數(shù)量眾多。此具有生物相關(guān)性的細(xì)胞類型與高內(nèi)涵成像和分析結(jié)合使用使得神經(jīng)毒性檢測(cè)對(duì)于篩選先導(dǎo)化合物非常有價(jià)值，并有可能降低臨床前開(kāi)發(fā)成本和對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的需要。使用來(lái)自 Cellular Dynamics International 的分化人iPSC 源性iCell 神經(jīng)元開(kāi)發(fā)了所展示的示例檢測(cè)。

定量神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的完整性

高內(nèi)涵分可在 96 或 384 孔板中形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 3-5 天，然后用有毒化合物進(jìn)行 48-72 小時(shí)的挑戰(zhàn)。在 ImageXpress Micro 系統(tǒng)上使用針對(duì) ß-微管蛋白的標(biāo)記抗體對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。使用 MetaXpress高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的神經(jīng)突生長(zhǎng)應(yīng)用模塊進(jìn)行圖像分析，并使用 AcuityXpress 高內(nèi)涵信息學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。 

神經(jīng)突生長(zhǎng)應(yīng)用模塊可發(fā)現(xiàn)有或沒(méi)有核復(fù)染的細(xì)胞體，通可在 96 或 384 孔板中形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 3-5 天，然后用有毒化合物進(jìn)行 48-72 小時(shí)的挑戰(zhàn)。在 ImageXpress® Micro 系統(tǒng)上使用針對(duì) ß-微管蛋白的標(biāo)記抗體對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。使用 MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的神經(jīng)突生長(zhǎng)應(yīng)用模塊進(jìn)行圖像分析，并使用 AcuityXpress 高內(nèi)涵信息學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。 

神經(jīng)突生長(zhǎng)應(yīng)用模塊可發(fā)現(xiàn)有或沒(méi)有核復(fù)染的細(xì)胞體，通過(guò)細(xì)胞體的存在確定陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞，并識(shí)別從這些細(xì)胞延伸的熒光標(biāo)記的神經(jīng)突。幾個(gè)參數(shù)可表征神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，包括神經(jīng)突數(shù)量、生長(zhǎng)長(zhǎng)度以及每個(gè)細(xì)胞或每個(gè)視野的分支數(shù)量。然后可以計(jì)算每個(gè)孔中細(xì)胞數(shù)量和表型的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

圖 1：神經(jīng)突生長(zhǎng)應(yīng)用模塊結(jié)果。頂部：使用神經(jīng)突生長(zhǎng)應(yīng)用模塊產(chǎn)生的圖像分析掩膜的對(duì)照和高劑量孔。標(biāo)記為 ß -微管蛋白 III（綠色）的神經(jīng)突和細(xì)胞核（藍(lán)色）。左下角：總生長(zhǎng)的細(xì)胞毒性化合物的劑量-反應(yīng)曲線。右下角：根據(jù)總生長(zhǎng)曲線計(jì)算 IC50 值。 

評(píng)估線粒體膜電位

線粒體去極化已被證明是缺氧損傷或細(xì)胞毒性的早期征兆，可使用 JC-10 染料監(jiān)測(cè)線粒體膜電位（圖 2）。在健康細(xì)胞中，JC-10 以橙色 J-聚集體的形式在線粒體中蓄積。隨著內(nèi)膜電位的損失，JC-10 的單體形式被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光。

神經(jīng)元用 JC-10 染色，并暴露于抗霉素A或纈氨酸霉素30分鐘，抗霉素A或纈氨酸霉素是導(dǎo)致氧化呼吸中斷和Ca2+超載的化合物。MetaXpress軟件中的顆粒度模塊可根據(jù)高于背景的強(qiáng)度和顆粒對(duì)象的大小進(jìn)行定制以識(shí)別線粒體。將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為視野中的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

監(jiān)測(cè)活細(xì)胞毒性

可使用細(xì)胞活力染料Calcein AM 和 Hoechst 細(xì)胞核染料組合對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行毒性檢測(cè)。使用 帶有能夠維持孔板溫度、CO2 和濕度水平的環(huán)控裝置的ImageXpress Micro 系統(tǒng)測(cè)試了許多已知的神經(jīng)毒性和無(wú)毒性化合物（圖 3）。觀察到的這些化合物的神經(jīng)毒性活性與體內(nèi)或臨床數(shù)據(jù)相關(guān)，從而證實(shí)了該測(cè)定法可用于預(yù)測(cè)性神經(jīng)毒理學(xué)的可能性。

由于 Calcein AM 除對(duì)活神經(jīng)元的細(xì)胞體外，還對(duì)神經(jīng)元延伸進(jìn)行染色，因此使用神經(jīng)突生長(zhǎng)應(yīng)用模塊對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并且使用細(xì)胞分類應(yīng)用模塊通過(guò) Calcein AM 染色和核大小來(lái)識(shí)別活神經(jīng)元和死神經(jīng)元。

圖 2.  經(jīng)抗霉素A處理的神經(jīng)元。頂部：對(duì)照神經(jīng)元和經(jīng)抗霉素A 處理并用 JC-10 染色的神經(jīng)元的圖像。使用 20X 物鏡采集顯示的圖像。底部：通過(guò)每個(gè)細(xì)胞的平均總線粒體/顆粒來(lái)測(cè)定劑量反應(yīng)。

圖 3.  甲基汞對(duì)神經(jīng)元的影響。頂部：顯示甲基汞對(duì)神經(jīng)元的劑量依賴性毒性作用的圖像。Calcein AM 的存在表示活細(xì)胞的代謝（綠色）。左下角：通過(guò)神經(jīng)突生長(zhǎng)確定細(xì)胞毒性化合物的 IC50 曲線，并通過(guò)核大小評(píng)估細(xì)胞毒性。右下角：Hoechst 染色細(xì)胞核為偽彩紅色。

用于神經(jīng)元毒性篩選的完整解決方案

Molecular Devices 利用 ImageXpress Micro 系統(tǒng)、MetaXpress 軟件和 AcuityXpress 軟件為在篩選環(huán)境中評(píng)估神經(jīng)元毒性提供完整的解決方案。我們的活細(xì)胞選項(xiàng)與復(fù)雜的表型圖像分析相結(jié)合，可在藥物開(kāi)發(fā)的早期階段識(shí)別毒性化合物。