簡介

細胞遷移，廣義上被定義為細胞從一個位置移動到另一個位置，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合等各種過程中發(fā)揮重要作用。它也是，癌細胞從原始位置擴散到身體不同部位轉(zhuǎn)移的一個關(guān)鍵參數(shù)，參與包括腫瘤細胞侵襲、進入血管系統(tǒng)和遠端定植等過程1。在體外，細胞會根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)等化學信號發(fā)生遷移，這種化學吸引力可以用于研究細胞遷移機制。通過了解癌細胞遷移的機制，可以開發(fā)新的治療方法來阻止癌癥患者的癌細胞轉(zhuǎn)移。

Corning FluoroBlokTM嵌套可以將細胞懸浮液與含化學引誘劑的底層溶液分離，使研究人員能夠測定細胞遷移或侵染。利用黑色染料處理的熒光屏蔽聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜可以有效地阻止的400-700 nm光透射。熒光標記的細胞遷移通過膜中的8.0 um孔徑達到化學引誘劑，利用酶標儀或成像系統(tǒng)通過底部讀取可以很容易檢測到細胞（圖1）。在檢測過程中遷移細胞仍能存活，可實現(xiàn)終點和時間過程的測定。

使用FluoroBlok 嵌套，從微孔板底部讀取原始熒光可用于測定細胞遷移，但這種方法存在局限性。標準化RFU（相對熒光）測量需要細胞的標準曲線，熒光細胞標記、背景熒光和其他條件的變化可能會影響數(shù)據(jù)準確性。通過直接計數(shù)細胞，研究人員可以獲得準確的細胞遷移數(shù)據(jù)。

在這篇應(yīng)用文章中，我們展示了如何使用 SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機和 SpectraMax® MiniMax 300細胞成像系統(tǒng)結(jié)合FluoroBlok嵌套測量細胞遷移以及對細胞進行成像和計數(shù)。

優(yōu)勢

采集無損的高質(zhì)量細胞圖像

通過直接計數(shù)細胞獲得準確的數(shù)據(jù)

使用SoftMax Pro軟件快速識別細胞

圖 1：FluoroBlok技術(shù)。熒光標記的細胞被接種在FluoroBlok嵌套中，通過8 um孔徑遷移，從底部進行檢測。

Materials

•       FluoroBlok HTS96孔多孔滲透支持系統(tǒng)，采用 8.0 um高密度PET膜（Corning cat. #351163）

•       SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機（Molecular Devices cat. #i3x）

•       SpectraMax MiniMax300細胞成像系統(tǒng)（Molecular Devices, cat. #5024062）

•       NIH3T3細胞（ATCC cat. #CRL-1658）

•       最小必需培養(yǎng)基（MEM,Corning cat. #10-010）

•       胎牛血清（FBS,Gemini Bio-Productscat. #100-106）

•       0.05%胰蛋白酶EDTA（Corning cat. #25-051-CI）

•       EarlyTox 活細胞檢測試劑盒（Molecular Devices  cat. #R8342）

方法

使用10%FBS在MEM中培養(yǎng)NIH3T3細胞。將細胞進行胰蛋白酶處理并重懸于無血清培養(yǎng)基中，然后用EarlyTox活細胞檢測
試劑盒中的4 µM 鈣黃綠素AM染色。染色后，在FluoroBlokTM嵌套中每孔加入20k 個細胞。將含有FBS的培養(yǎng)基作為細胞遷移的化學引誘劑，無血清培養(yǎng)基作為陰性對照。血清培養(yǎng)基被用作
陰性對照。

表 1 采集和分析設(shè)置

在SoftMax Pro軟件中創(chuàng)建自定義板設(shè)置，以適應(yīng)FluoroBlok的尺寸。在設(shè)置中的板類型窗口中選擇編輯孔板，并根據(jù)Corning提供的孔板信息修改尺寸。修改后的孔板設(shè)置被保存在新名稱下。此自定義板設(shè)置參數(shù)可用于之后的FluoroBlok實驗。MiniMax細胞成像系統(tǒng)可用于采集通過PET膜遷移的NIH3T3細胞的圖像。使用表 1中列出的采集設(shè)置，在20小時內(nèi)的多個時間點采集圖像。讀板機的內(nèi)部溫度被設(shè)置為37°C，以在讀板過程中最大限度地保證細胞健康。

圖 2. 目標物識別。 使用SoftMax Pro軟件采集編輯器中的點單擊（point and click）功能識別NIH3T3細胞。在圖 A中，用戶可以通過點擊已知細胞（黃色標記）來設(shè)置熒光大小和強度。軟件識別的對象標記為紫色 （B）。使用分類工具，用戶可以區(qū)分細胞（紅色掩膜）和較小的孔（藍色掩膜）（C）。

圖 3. 使用MiniMax細胞成像系統(tǒng)追蹤細胞遷移。接種細胞后0小時（A和D）、接種后20小時（B和E）以及軟件識別的對象（C和F）采集的圖像。C和F中的紅色掩膜表示分類為細胞的物體，藍色掩膜表示分類為FluoroBlok膜孔的小物體。頂行顯示含有化學引誘劑的孔，底行顯示不含化學引誘劑的孔（陰性對照）

使用SoftMax Pro軟件識別和定量遷移的NIH3T3細胞。在圖像分析設(shè)置中選擇離散目標物分析作為分析類型。根據(jù)細胞熒光強度和大小識別細胞，在軟件中創(chuàng)建自定義設(shè)置（圖 2）。通過點擊4至6個代表性
細胞，可自動設(shè)置閾值，并由軟件識別細胞。使用軟件對遷移的細胞數(shù)量進行繪制。

結(jié)果

使用MiniMax細胞成像系統(tǒng)和SoftMax Pro軟件，在熒光染色細胞通過 FluoroBlok 孔板遷移時對其進行檢測（圖 3）。雖然在不含化學引誘劑的孔中也有一些遷移，但在化學引誘劑存在的情況下，20小時后細胞遷移增加近3倍（圖 4）。

圖 4. 細胞遷移計數(shù)。 使用SoftMax Pro軟件對NIH3T3細胞計數(shù)進行繪圖。含有趨化劑的孔以紅色顯示，陰性對照孔以綠色顯示。前兩小時內(nèi)兩種條件處理的細胞均顯示發(fā)生了遷移，但含有趨化劑的孔板中的細胞計數(shù)隨著時間的推移持續(xù)增加。

結(jié)論

SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機和MiniMax細胞成像系統(tǒng)可與FluoroBlok細胞培養(yǎng)嵌套搭配使用，直接對高質(zhì)量圖像中的細胞進行計數(shù)，以測定細胞隨時間的遷移情況。用戶能夠通過點擊SoftMax Pro軟件的用戶界面快速設(shè)置細胞計數(shù)分析。與容易受細胞染色水平和背景熒光影響的原始熒光相比，圖像分析可提供準確的數(shù)據(jù)。通過將SoftMax Pro軟件的圖像采集和分析功能與96孔FluoroBlok嵌套相結(jié)合，研究人員可以快速評估大量細胞遷移數(shù)據(jù)，以推進其在癌癥和許多其他生物學領(lǐng)域的研究。

參考文獻

1. Chambers, Ann F., Alan C. Groom, and Ian C. MacDonald. Metastasis: dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer Nature Reviews Cancer 2.8（2002 年）：563.