簡(jiǎn)介

為了更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境并且預(yù)測(cè)化合物的功效和毒性，細(xì)胞模型變得愈加復(fù)雜。人們對(duì)使用三維 （3D） 細(xì)胞球進(jìn)行組織生物學(xué)建模和毒性評(píng)估越來越感興趣。使用 3D 培養(yǎng)物開發(fā)通量更高的定量檢測(cè)是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。在本研究中，我們開發(fā)了用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 （iPSC）形成 3D 細(xì)胞球的方法。使用高內(nèi)涵成像 （HCI） 和快速動(dòng)力學(xué)熒光成像 （FLIPR），我們用鈣敏感染料監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化，測(cè)量了各種化合物對(duì)心臟細(xì)胞球搏動(dòng)率和模式的影響。

心臟細(xì)胞球的形成

使用了來自 Cellular Dynamics International （CDI） 的冷凍保存的iCell心肌細(xì)胞進(jìn)行此研究。將細(xì)胞解凍并鋪板至超低吸附的（ULA） U 形底 96 孔板（20，000 個(gè)細(xì)胞/孔）和384 孔板（Corning）中（10，000 個(gè)細(xì)胞/孔），并在維持培養(yǎng)基中孵育 4 天以形成細(xì)胞球培養(yǎng)物。心臟細(xì)胞球在 48 小時(shí)內(nèi)由 iPSC 源性心肌細(xì)胞有效形成，并在培養(yǎng) 3-4 天后自發(fā)收縮。然后，這些 3D 細(xì)胞模型可用 Ca2+ 敏感染料染色以評(píng)估心臟毒性。細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 流引起的熒光強(qiáng)度變化被用作細(xì)胞球收縮的替代標(biāo)記。在對(duì)心臟活性和心臟毒性化合物的刺激下，觀察到基線搏動(dòng)模式的顯著改變。

我們?cè)谶@里描述了兩種記錄、定量和表征 iPSC 源性心臟細(xì)胞球搏動(dòng)模式的方法：使用高內(nèi)涵成像（ImageXpress® Micro 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)）和快速動(dòng)力學(xué)熒光成像（FLIPR Tetra® 高通量細(xì)胞篩選系統(tǒng)）。

優(yōu)勢(shì)

使用高內(nèi)涵成像采集延時(shí)圖像并分析心臟細(xì)胞球搏動(dòng)模式

使用 FLIPR Tetra system 對(duì)所有孔中的鈣流進(jìn)行同步動(dòng)力學(xué)
讀取測(cè)量不同化合物對(duì)心臟細(xì)胞球活性的影響

圖 1：檢測(cè)工作流程示意圖。將 iCell 心肌細(xì)胞2 解凍并鋪板至 U 形底部低附著板中以形成 3D 心臟細(xì)胞球。培養(yǎng) 4 天后，用化合物處理細(xì)胞球所需的時(shí)長(zhǎng)，用 FLIPR 鈣 6 染料染色，并使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)采集延時(shí)圖像。

使用高內(nèi)涵成像隨時(shí)間推移采集和分析心臟細(xì)胞球
成像方法可精確檢測(cè)和可視化心臟細(xì)胞球，并包括在所需的時(shí)間周期和頻率內(nèi)采集延時(shí)圖像。
本研究中使用的檢測(cè)工作流程如圖 1 所示。ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)使用自動(dòng)延時(shí)采集獲得細(xì)胞球圖像。記錄了整個(gè)細(xì)胞球的鈣流模式，發(fā)現(xiàn)其與收縮同步（圖 2）。記錄頻率設(shè)置為 10-20 次讀取/秒，每孔 5-10 秒（或更長(zhǎng)）的讀取時(shí)間，使用 FITC 激發(fā)和發(fā)射濾光片，放大倍數(shù)為 20 倍或 10 倍。將細(xì)胞保存在環(huán)境控制下（37 °C，5% CO2）或密封。為實(shí)現(xiàn)更高的讀數(shù)頻率，激發(fā)時(shí)間為 10 ms 或更短。該成像方法對(duì)任何細(xì)胞球尺寸都有效。我們測(cè)試了從每孔 3，000-20，000 個(gè)平板細(xì)胞制備的細(xì)胞球。我們證明，跳動(dòng)頻率不依賴于細(xì)胞球大?。〝?shù)據(jù)未顯示）。使用標(biāo)準(zhǔn)推薦操作規(guī)程，使用 Hoechst 細(xì)胞核染色和 FLIPR®鈣 6 染料 （Molecular Devices， LLC） 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

圖 2. 加載 Ca2+ 敏感染料的iPSC 源性心肌細(xì)胞球收縮的延時(shí)圖像系列。 每個(gè)圖像均以 100 毫秒的間隔拍攝。黃色/紅色（偽彩）表示高 Ca2+ 濃度和收縮狀態(tài)。

圖 3. 化合物處理的心臟細(xì)胞球的動(dòng)態(tài)熒光強(qiáng)度。將圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SoftMaxPro 7 軟件，用于分析跳動(dòng)率、振幅、峰寬和其他讀數(shù)。此處顯示的是延時(shí)強(qiáng)度圖的板視圖。

使用 MetaXpress Journal（可應(yīng)要求提供）分析圖像。Journal會(huì)自動(dòng)查找細(xì)胞球，確定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度，并以板格式保存每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的強(qiáng)度數(shù)據(jù)。通過保存細(xì)胞球圖像的延時(shí)堆棧，視頻剪輯可保存在成像軟件中。通過在Display模式下顯示強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系，可以查看跳動(dòng)模式。每次延時(shí)拍攝的強(qiáng)度數(shù)據(jù)也可以導(dǎo)出為 Excel 格式。可使用SoftMax Pro 7 軟件（圖 3）對(duì)跳動(dòng)模式進(jìn)行進(jìn)一步分析，軟件可導(dǎo)入強(qiáng)度數(shù)據(jù)、分析跳動(dòng)模式并定義主要參數(shù)，包括通量、跳動(dòng)振幅、峰寬或衰減時(shí)間的變化1，2。使用幾種測(cè)試化合物觀察到的
鈣流頻率的濃度依賴性曲線如圖 4 所示。表 1 顯示了使用鈣流頻率作為讀數(shù)，計(jì)算的選定化合物的 IC 值。

圖 4. 由選定化合物引起的搏動(dòng)頻率的劑量依賴性變化圖。

表 1 根據(jù)鈣流頻率的濃度依賴性變化計(jì)算的選定化合物的 IC50 值。

使用高內(nèi)涵成像評(píng)估細(xì)胞球活性
這種高內(nèi)涵成像方法也可用于定義不同化合物對(duì)細(xì)胞活性的影響。例如，我們證明，在化合物處理后，可通過性染料組合染色來評(píng)估心臟細(xì)胞球的
細(xì)胞活力：鈣黃素 AM（取決于酯酶活性的活細(xì)胞染色）、Ethidium 同型二聚體（細(xì)胞不可滲透的死細(xì)胞指示劑）和 Hoechst（標(biāo)記所有細(xì)胞的細(xì)胞滲透性核染色，包括活細(xì)胞和死細(xì)胞群），可在即用型 EarlyTox 活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測(cè)試劑盒中獲得。
用染料孵育兩小時(shí)后，使用 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)對(duì)染色的細(xì)胞球進(jìn)行成像。
使用 10x 或 20x 放大倍率拍攝 Z 層圖像，間隔 10 μm，范圍約為 150 μm。
使用 MetaXpress 軟件使用 2D 和 3D 分析模塊分析細(xì)胞球內(nèi)總活細(xì)胞和死細(xì)胞的圖像。先前描述了用于分析細(xì)胞球以檢測(cè)活性標(biāo)記物的方法3。圖 5 顯示了對(duì)照和地高辛處理的細(xì)胞球的示例分析?？墒褂靡韵聹y(cè)量值進(jìn)行化合物效應(yīng)的多參數(shù)
評(píng)估：細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞球大小和細(xì)胞活性。

圖 5. 使用 iPSC 源性心臟細(xì)胞球進(jìn)行心臟毒性成像。（上圖）對(duì)照和地高辛處理的細(xì)胞球用活性標(biāo)記物染色：Calcein A（綠色）、Hoechst（藍(lán)色）和EthD-1（紅色）。（下圖）圖像分析mask顯示藍(lán)色細(xì)胞球、粉色活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和黃色死細(xì)胞。

使用 FLIPR Tetra 系統(tǒng)監(jiān)測(cè)搏動(dòng)心肌細(xì)胞球中的 鈣流，從而優(yōu)化高通量篩選

相比，FLIPR Tetra 系統(tǒng)與一次僅對(duì)一個(gè)孔進(jìn)行延時(shí)成像的高內(nèi)涵成像方法相比，FLIPR Tetra系統(tǒng)可以同時(shí)讀取整塊板的熒光強(qiáng)度，因此可以對(duì)所有孔進(jìn)行鈣流的同步動(dòng)力學(xué)讀取。該系統(tǒng)還可以兼容自動(dòng)化液體和平板處理。
ScreenWorks Peak Pro 軟件模塊可用于分析和表征跳動(dòng)曲線，從而產(chǎn)生跳動(dòng)速率、峰值頻率和寬度或不規(guī)律波形等多參數(shù)輸出。

圖 6. 對(duì)測(cè)試化合物的心臟細(xì)胞球反應(yīng)進(jìn)行快速動(dòng)力學(xué)熒光分析。

（A）比較經(jīng)選定化合物處理并使用 FLIPR Tetra 儀器測(cè)量的心臟細(xì)胞球的 鈣流曲線。頻率、振幅、峰寬和其他參數(shù)ScreenWorks PeakPro 軟件模塊自動(dòng)計(jì)算。（B） 測(cè)試化合物對(duì)心臟細(xì)胞球搏動(dòng)率影響的劑量-反應(yīng)圖。

iPSC 源性心臟細(xì)胞球的鈣流檢測(cè)，使用 FLIPR Tetra系統(tǒng)的 96 孔或 384 孔板中進(jìn)行了高通量篩選 （HTS）優(yōu)化。如前所述，在低附著 U 底板中形成心臟細(xì)胞球。我們觀察到，如果細(xì)胞球尺寸相對(duì)較大（300-500 μm，由 10，000-20，000 個(gè)鋪板細(xì)胞形成），FLIPR Tetra 系統(tǒng)可更有效地檢測(cè)細(xì)胞球。使用 FLIPR 鈣 6 染料監(jiān)測(cè)與細(xì)胞搏動(dòng)同步的 鈣流的變化。將試劑（2X 濃度）添加到板中，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 2 小時(shí)。將細(xì)胞球暴露于化合物中 2 小時(shí)或 24 小時(shí)。使用 FLIPR Tetra系統(tǒng)以每秒約 8 幀的速度采集藥物前讀數(shù)，其中激發(fā)波長(zhǎng)為 485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 530 nm。在不同化合物孵育時(shí)間后采集額外的讀數(shù)，以了解不同化合物暴露時(shí)間之間的關(guān)系。鈣流的記錄通常持續(xù)約 2 分鐘，以獲得可靠的數(shù)據(jù)集。

為了說明 FLIPR Tetra 快速動(dòng)力學(xué)熒光成像在測(cè)定3D 細(xì)胞模型方面的適用性，我們將心臟細(xì)胞球置于幾種已知的心臟活性和心臟毒性化合物中，包括 α和 β-受體阻滯劑（異丙腎上腺素、普萘洛爾和維拉帕米）、已知影響 hERG 通道的化合物（鹵吡多）和離子通道阻滯劑（利多卡因）。此外，還測(cè)試了幾種環(huán)境毒素，包括殺蟲劑（羅滕酮）、阻燃劑（磷酸三苯酯）和其他毒性化學(xué)物質(zhì)。

治療以劑量依賴性方式顯著改變了跳動(dòng)模式。對(duì)照和測(cè)試化合物處理的心臟細(xì)胞球的鈣流（搏動(dòng)）模式如圖 6A 所示。毫不奇怪，化合物處理極大地改變了劑量依賴性分子的跳動(dòng)模式（圖 6B）。然而，將 3D 細(xì)胞球培養(yǎng)物測(cè)定的 IC50值與以傳統(tǒng) 2D 形式鋪板的細(xì)胞獲得的細(xì)胞顯示出測(cè)定靈敏度的顯著差異，其中 3D 培養(yǎng)物在反應(yīng)方面顯示出一般的右移趨勢(shì)（即 IC 值更高）（表 2）。與傳統(tǒng)的 2D 培養(yǎng)形式相比，降低對(duì)這些測(cè)試化合物的心臟細(xì)胞球敏感性是否更具預(yù)測(cè)性，將需要額外的跟進(jìn)。盡管如此，這些結(jié)果表明，將小型 iPSC 源性心臟 3D 細(xì)胞模型與快速動(dòng)力學(xué)熒光成像相結(jié)合，以支持高通量心臟毒性篩選的潛在效用。

表 2. 根據(jù)兩種不同形式的經(jīng)測(cè)試化合物處理的 iPSC 源性心肌細(xì)胞計(jì)算的鈣流 IC 值比較：3D 細(xì)胞球與傳統(tǒng) 2D 培養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)

1.       Sirenko， O.， C. Crittenden， N. Callamaras， J. Hesley， Y.-W. Chen、C. Funes、I. Rusyn、B. Anson 和 E. F. Cromwell。“使用 IPSC 細(xì)胞對(duì)化合物對(duì)心肌細(xì)胞生理學(xué)的影響進(jìn)行多參數(shù)體外評(píng)估。” 生物分子篩選雜志 18.1（2012 年）：39-53. 網(wǎng)絡(luò)。

2.       Sirenko、Oksana、Evan F. Cromwell、Carole Crittenden、Jessica A. Wignall、Fred A. Wright 和 Ivan Rusyn。“評(píng)估人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的搏動(dòng)參數(shù)可實(shí)現(xiàn)體外心臟毒性定量篩選。” 毒理學(xué)和應(yīng)用藥理學(xué) 273.3（2013 年）：500-07. 網(wǎng)絡(luò)。

3.       Sirenko、Oksana、Michael K. Hancock、Jayne Hesley、Dihui Hong、Avrum Cohen、Jason Gentry、Coby B. Carlson 和 David A. Mann。“使用共聚焦成像和三維圖像分析對(duì) IPSC 對(duì)肝臟細(xì)胞球的毒性化合物效應(yīng)進(jìn)行表型表征。” 檢測(cè)和藥物開發(fā)技術(shù) 14.7（2016 年）：381-94. 網(wǎng)絡(luò)。