概要

l   在 Biomek FX 工作站上自動進(jìn)行基質(zhì)膠培養(yǎng)物的平板接種、藥物治療和染色

l   溫度控制位置保持基質(zhì)膠呈液體形式并誘導(dǎo)膠化

l   通過減少基質(zhì)膠的使用，優(yōu)化移液可節(jié)省成本

l  使用以下方法測定基質(zhì)膠培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長和凋亡誘導(dǎo)：

l  配備 SpectraMax MiniMax 300 成像細(xì)胞計數(shù)器的 SpectraMax i3X 多功能檢測平臺

l  ageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)

簡介

研究人員正在將三維 （3D） 細(xì)胞培養(yǎng)作為一種提高其疾病模型和藥物研究預(yù)測價值的生物學(xué)相關(guān)性的方法。這些 3D 模型通常會提高細(xì)胞間相互作用的水平，并減少或消除了在標(biāo)準(zhǔn)單層培養(yǎng)物中觀察到的明顯的細(xì)胞-塑料介質(zhì)間相互作用。有多種生成方法3D 細(xì)胞培養(yǎng)物，每種具有優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，有些挑戰(zhàn)可以通過自動化幫助克服。

在三維空間中培養(yǎng)細(xì)胞的一種常見方法是通過使用細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠如 Matrigel。Matrigel 和 2D 細(xì)胞培養(yǎng)物之間的差異可通過其不同的細(xì)胞形態(tài)很容易地看到（圖 1），細(xì)胞極性和/或基因表達(dá)（Baker 和 Chen）。Matrigel 還可以研究細(xì)胞遷移和3D 結(jié)構(gòu)形成，例如血管生成研究中的內(nèi)皮細(xì)胞管形成

Matrigel 的特性之一是它僅在低溫條件下是液態(tài)，在室溫下或 37°C 下凝固成凝膠。 細(xì)胞通常生長在基質(zhì)膠涂層上或包埋在較厚的基質(zhì)凝膠層（圖 1）中，補(bǔ)充介質(zhì)通常添加到水凝膠層之上，隨后凝固。在 Matrigel 中檢測細(xì)胞生長也可能存在問題。檢測方法包括使用讀板機(jī)或成像設(shè)備

在細(xì)胞仍留在基質(zhì)中或緩慢溶解基質(zhì)膠的同時對其進(jìn)行檢測，以觀察懸浮細(xì)胞或裂解物。所有這些步驟在手動執(zhí)行時都面臨重大挑戰(zhàn)，我們將介紹我們?nèi)绾卫?/span>自動化來進(jìn)行平板接種、處理和制備 Matrigel 培養(yǎng)物進(jìn)行分析。此外，自動化技術(shù)使用 384 孔板，可減少每個步驟中基質(zhì)膠和其他昂貴試劑的使用量，從而節(jié)省大量成本。

圖 1：在標(biāo)準(zhǔn)單層培養(yǎng)物 （A）、基質(zhì)膠表面（B）或嵌入基質(zhì)膠層中（C）的 HCT 116 細(xì)胞的圖像。比例尺 = 500 微米。

自動化基質(zhì)膠鋪板和培養(yǎng)

Matrigel 工作流程在 Biomek FX 工作站（貝克曼庫爾特公司）上自動進(jìn)行，該工作站具有 96 通道頭和 Span-8

移液器（圖 2）。靈活的 Biomek 工作站配置了多個溫度控制的 Peltier 位置以液體形式維持基質(zhì)凝膠，并加熱檢測板以誘導(dǎo)凝膠聚合。96 通道頭增強(qiáng)多通道選擇性吸頭移液 （EST），允許使用任何吸頭模式。自動化細(xì)胞的無菌性操作通過使用無菌 Biomek 移液器吸頭和 HEPA 過濾外殼進(jìn)行保護(hù)，且無污染即使在細(xì)胞培養(yǎng)基中沒有抗生素的情況下也能檢測到無污染。

細(xì)胞鋪板

用 FluoroBrite DMEM 培養(yǎng)基（Thermo Fisher科學(xué)）稀釋冰上解凍的無酚紅的基質(zhì)膠（Corning）至6mg/ml，對于嵌入式培養(yǎng)，將 HCT 116 細(xì)胞加入至 100，000 個細(xì)胞/mL 的濃度?；|(zhì)膠將（+/- 細(xì)胞）添加到深孔板的單柱中，該單柱在振蕩的 Peltier 裝置上用深孔適配器保持 4°C，。使用多通道 EST 功能以柱狀方式向 384 孔黑壁透明底板 （Greiner） 的孔中加入 25 μL 。然后將該檢測板在靜態(tài)Peltier上加熱至37°C，持續(xù)30分鐘，以固化基質(zhì)膠。然后將含有 10% FBS 的 75 μL FluoroBrite DMEM 培養(yǎng)基加入每個孔中。對于在基質(zhì)膠表面的培養(yǎng)物生長，HCT 116 細(xì)胞添加到補(bǔ)充培養(yǎng)基中，而不是添加到基質(zhì)膠中。最終細(xì)胞接種數(shù)量為2500 個細(xì)胞/孔用于嵌入式培養(yǎng)，8000 個細(xì)胞/孔用于表面培養(yǎng)。

如上所述，在接種基質(zhì)膠培養(yǎng)時存在許多挑戰(zhàn)。自動化能夠始終如一地將移液槍頭置于孔底上方 0.3 mm 處，使少量的基質(zhì)膠將擴(kuò)散到覆蓋整個孔。需要手動移液會接觸孔底（可能劃傷和/或影響轉(zhuǎn)移體積）或孔的側(cè)面，導(dǎo)致基質(zhì)凝膠液滴粘附在孔的側(cè)面，且未能覆蓋孔。通過手動轉(zhuǎn)移可以實現(xiàn)穩(wěn)定的孔覆蓋是將基質(zhì)膠體積加倍至 50μL，導(dǎo)致實驗成本翻倍。

自動化鋪板的另一個優(yōu)勢是能夠使用慢速抽吸、分配和混合速度以避免Matrigel 溶液中產(chǎn)生氣泡。我們還向移液管吸頭中額外抽吸少量基質(zhì)膠，以避免分配至檢測板時引入氣泡。雖然它們是 Matrigel 培養(yǎng)物的常見抱怨，但

在自動平板接種后沒有在培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)氣泡。培養(yǎng)物在處理和/或分析之前在 37°C 下在 5% CO2 培養(yǎng)箱中儲存不同時間。

細(xì)胞生長檢測

為測定基質(zhì)膠表面培養(yǎng)物的初始細(xì)胞生長，在前三天的培養(yǎng)中，每天向孔中加入 100 μL XTT 試劑。使用 SpectraMax i3X 多功能檢測平臺在 475 nm 和 660 nm 處測量吸光度（“SpectraMax i3X 讀板機(jī)"，Molecular Devices，圖 2）。觀察到線性生長速率 （R2 = 0.985），表明在該時間范圍內(nèi)生長 8000 個細(xì)胞（圖 3A）。第 3 天吸光度的輕微穩(wěn)定可能反映出生長變慢，但更有可能表明我們即將達(dá)到 XTT 檢測的吸光度最大值，縮短試劑孵育時間以獲得更多時間點(diǎn)。

圖 2. 使用Biomek FX 工作站（左）對基質(zhì)膠培養(yǎng)物進(jìn)行鋪板、處理和染色。然后用配備 MiniMax 細(xì)胞計數(shù)器的 SpectraMax i3X 讀板機(jī)（中間）或 ImageXpress Micro 共聚焦系統(tǒng)（右圖）分析。

由于 XTT 檢測是一種終點(diǎn)檢測，我們還試圖以非標(biāo)記方式追蹤細(xì)胞生長。我們使用 SpectraMax

i3X 讀板機(jī)，配備 SpectraMax MiniMax 300 成像細(xì)胞計數(shù)器（“MiniMax 細(xì)胞計數(shù)器"，Molecular Devices），用于測量被表面菌落占據(jù)的孔的百分比（“field"分析設(shè)置）。盡管平板基質(zhì)膠的輕微凹面妨礙了平面的清晰，但隨著時間的推移很容易檢測到表面菌落融合度的變化（數(shù)據(jù)未顯示）。更重要的是，這些培養(yǎng)物的菌落形態(tài)使得細(xì)胞數(shù)量翻倍可能不會融合度增加兩倍。XTT 檢測可提供更準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)量增加表現(xiàn)，但成像方法可作為合理的替代方法，以確保細(xì)胞生長穩(wěn)定，同時允許細(xì)胞在未來繼續(xù)用于實驗。

在對嵌入基質(zhì)膠的培養(yǎng)物進(jìn)行成像時，缺乏焦平面甚至更具挑戰(zhàn)性。但是，我們能夠使用在 MiniMax 細(xì)胞計數(shù)儀上進(jìn)行場測量，以再次查看接受不同細(xì)胞接種的孔之間的差異 以及跟蹤隨時間推移的增長。圖 3B 顯示了在 MiniMax 細(xì)胞儀上采集和分析的孔圖像以識別存在細(xì)胞的區(qū)域。人們可以看到，在三天的時間內(nèi)，被識別的細(xì)胞數(shù)量不斷增加。該圖 3C 繪制了其他細(xì)胞鋪板數(shù)的融合度水平。同樣，雖然可能不是直接的測定細(xì)胞數(shù)量增加，但生長曲線中的高線性水平（R2 值在 0.968 至0.999），且接種細(xì)胞數(shù)量之間的清晰的區(qū)別表明這種方法可用于追蹤以非標(biāo)記方式包埋基質(zhì)膠培養(yǎng)物。

圖 3. 分析基質(zhì)膠上/基質(zhì)膠中的細(xì)胞生長。A） 對在三天內(nèi)在基質(zhì)膠表面生長的 8000 個細(xì)胞的 XTT 測定。

使用 XTT 試劑孵育 4 小時后，在 SpectraMax i3X 讀板機(jī)上進(jìn)行光吸收檢測。B） Matrigel中HCT116細(xì)胞 的匯合度

使用帶 MiniMax 細(xì)胞計數(shù)器的 SpectraMax i3X 讀板機(jī)進(jìn)行現(xiàn)場分析測量，。圖像顯示

在三天內(nèi)增加 2500 個細(xì)胞的識別面積。C） 不同起始細(xì)胞數(shù)量的融合度測量圖。

在最初三天培養(yǎng)中，所有細(xì)胞數(shù)量的融合度均呈高度線性（R2 0.968 至 0.999）。

化合物處理和凋亡分析

化合物稀釋和添加

3D 培養(yǎng)的目標(biāo)之一是確定細(xì)胞在更具生物相關(guān)性的系統(tǒng)中對刺激的反應(yīng)。我們想確定在 Matrigel 中生長的結(jié)腸癌細(xì)胞如何對凋亡誘導(dǎo)劑作出反應(yīng)。接種 HCT 116 細(xì)胞后 5 天將細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)化合物用 NucBlue® Live ReadyProbes® 試劑（Thermo FisherScientific）稀釋至以下濃度：10 μM 星孢菌素、20 μM 喜樹堿和 375 μM5-氟尿嘧啶?；衔镉捎谛枰^長的孵育時間來對基質(zhì)膠中的細(xì)胞核進(jìn)行染色，因此在 NucBlue 中稀釋。添加這些溶液至 96 孔圓底板的第一行，Span-8 移液器將含 1% DMSO 的 NucBlue 轉(zhuǎn)移至板的剩余行。然后使用 EST 按 1：3 的順序連續(xù)稀釋化合物，留下最后一行作為陰性對照（僅 DMSO）。

從 100 μL 液體高度開始，從 Matrigel 孔中吸取 10 μL 培養(yǎng)基在抽吸過程中跟隨液體液位。這不僅可以確保我們不會破壞基質(zhì)膠，而且可以使由于蒸發(fā)（即邊緣孔）導(dǎo)致的培養(yǎng)基損失回歸至與板其余部分相同的體積，因為空氣將被抽吸直至移液管尖的一端達(dá)到液體。此體積標(biāo)準(zhǔn)化可確保整添加 10 μL 化合物稀釋液到復(fù)孔中后，整個板的化合物最終濃度準(zhǔn)確。

凋亡檢測

化合物處理 24 小時后，加入 10 μL CellEvent® Caspase-3/7 Green （Thermo Fisher Scientific） 并培養(yǎng)在 37°C 下孵育 6 小時以對凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色。使用 ImageXpress® Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)采集細(xì)胞圖像高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（“ImageXpress Micro 共聚焦系統(tǒng)"，Molecular Devices，圖 2）?？自?/span> DAPI 和 FITC 濾光片下進(jìn)行 4X放大。這種較低的放大倍率允許對整個孔進(jìn)行成像，并通過采集Z-stacks，我們能夠在三維空間中可視化嵌入的細(xì)胞，如圖 4A 所示。圖 4B 顯示了對每種誘導(dǎo)劑前 5 種稀釋度的復(fù)孔所采集的 zstacks的二維投影。這些投影可用于計算埋于整個2 mm Matrigel 層中的總細(xì)胞（藍(lán)色細(xì)胞核）和caspase陽新細(xì)胞（綠色）包，用于確定每種化合物誘導(dǎo)的凋亡的相對水平。

各濃度下caspase陽性細(xì)胞的百分比（兩個復(fù)孔的平均值）如圖 4C 所示。無論是星孢菌素還是喜樹堿均達(dá)到最大毒性，并顯示出傳統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線，從而允許計算包埋在基質(zhì)膠中的 HCT 116 細(xì)胞的 IC50。ICIC50 為 6 nM 的星形孢菌素大約，對HCT 116 細(xì)胞的毒性比對喜樹堿的高出10倍，后者 IC50 為 80 nM。5-氟尿嘧啶的作用要弱得多，而在 3.75 μM 的最大濃度達(dá)到了50%毒性，其任何 IC50 值都不可靠。這種5-氟尿嘧啶的檢測較弱的效果也見于我們之前對 HCT 116 細(xì)胞 3D 模型的研究中。

圖 4. 誘導(dǎo) Matrigel 包埋培養(yǎng)物的凋亡。A） 使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)采集的圖像展示了三維集落，

熒光caspase 3/7 底物作為凋亡的標(biāo)記物。B） 使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)以 4X放大倍率采集的 Z-stacks的2D投射后的拼圖。用稀釋的 staurosporine、喜樹堿和 5-氟尿嘧啶（顯示前 5 種稀釋比例），并染色細(xì)胞核（藍(lán)色）和凋亡（綠色）。C） 每種化合物的成像數(shù)據(jù)生的成劑量-反應(yīng)曲線。

討論

基質(zhì)膠培養(yǎng)物對于許多研究都非常有價值。同時，我們演示了在 3D-培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的化合物篩選，Matrigel 還可應(yīng)用到其他需要三維空間的檢測，例如血管形成或神經(jīng)突生長的研究。然而，使用 Matrigel 檢測法的挑戰(zhàn)是巨大的。我們已展示了精細(xì)控制的移液速度和位置以及溫度調(diào)節(jié)如何使自動化克服了這些障礙。其中一個例子就是自動化如何使這些檢測小型化為384孔板，與手動電鍍或 96 孔板相比，384 孔板型的 Matrigel 使用量減少了 50%，從而節(jié)省了大量成本格式。這種更小的格式也需要更少的染色試劑，并可實現(xiàn)更快的共聚焦成像，因為對于96孔板拉私活捕獲整孔的圖像需要多個視野。

Biomek 工作站的靈活性還可實現(xiàn)多種的工作流程或通量。例如，我們執(zhí)行了在單個 Peltier 位置加熱 Matrigel 檢測板，但如果需要同時處理大量板，可以集成額外的 Peltier 或培養(yǎng)箱。更高通量的應(yīng)用還可通過集成板和槍頭存儲以及分像帶 MiniMax 細(xì)胞計數(shù)儀的 SpectraMax i3X 讀板機(jī)或 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)析儀。