單細胞測序的難點在于如何把不同類型的組織解離成單細胞懸液。目前,主要的單細胞分離方法有口吸法、顯微操作法、流式細胞法、微流控。
顯微操作法是一種能夠直接觀察到單細胞分離的方法。這一方法能夠準確控制單個細胞的吸取與釋放,但是對實驗操作的要求較高,不利于規(guī)?;僮鳎現ACS則能夠大規(guī)模獲得單細胞樣本,該方法是利用流式細胞儀,借助于細胞表面標記分選出特定群體的細胞或單個細胞。
雖然這一方法需要專門的設備,且細胞的消化和分選過程會對細胞狀態(tài)產生一定的影響,但是該方法的效率和準確率較高,標準統(tǒng)一,有利于不同實驗室實驗研究的比較,而流式和微流控的方法可以適用于大規(guī)模分離單細胞懸液,而大規(guī)模分離單細胞首先需要制備細胞活力較高的細胞懸液。
懸液制備和質控中的注意事項:
1、組織樣本制備懸液時間不超過4h;
2、單細胞分離懸液中不能含有Ca2+和Mg2+,且不能含有Tween80之類的表面活性劑,否則會影響細胞活性;
3、根據項目的情況選擇合適尺寸的細胞篩。細胞尺寸可選20~40μm不等,目的是濾掉雜質和細胞團;
4、解離好的細胞懸液武漢樣本庫技術服務平臺推薦細胞活率為85%以上,低于75%不能上機;
5、細胞懸液的適宜濃度700-1200cells/μL。濃度過高,上樣體積太小,誤差太大;濃度太低,體積太大,會帶入一些雜質和細胞團等;
6、細胞懸液制備完成后要盡快建庫,樣本制備好到上機的時間間隔不宜超30min。不能保證同時制備多個樣本的細胞懸液時,可能導致各樣本之間懸液制備間隔時間過長,此時則不建議一次完成多樣本建庫。