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重組人Flt3L表達(dá)出來的蛋白為什么比實際要小

2021-5-10  閱讀(950)

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   重組人Flt3L是一種膜蛋白,能夠刺激早期造血的細(xì)胞因子。在體、離體試驗均證實,可調(diào)節(jié)非紅系造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化,與多種細(xì)胞因子協(xié)同,可促進(jìn)前B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的增殖、分化和成熟,從而具有重要的抗腫瘤作用。本產(chǎn)品由真核細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白,是將蛋白基因接入穩(wěn)定表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化CHO-K1細(xì)胞,經(jīng)克隆篩選,質(zhì)量驗證,挑選的穩(wěn)定表達(dá)株,由化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基發(fā)酵制備,工藝穩(wěn)定,保證了產(chǎn)品質(zhì)量及批次間的一致性。
  重組人Flt3L表達(dá)出來的蛋白比實際要小是因為:
  1、蛋白本身被降解了,可以存在一些不利于該蛋白穩(wěn)定的蛋白酶
  2、翻譯起始位點的問題:如果一個類似于核糖體結(jié)合位點的序列加上適當(dāng)?shù)拈g隔序列出現(xiàn)在了ATG密碼子上游,降解就會有可能出現(xiàn)。解決的方法可以采用兩端都帶有融合標(biāo)簽的載體,全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度,在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區(qū)分開?;蛘咴诘鞍變啥瞬捎貌煌瑯?biāo)簽,進(jìn)而通過親和純化的方式得到全長蛋白。
  3、影響蛋白穩(wěn)定性的另外一個因素是與N端Met相鄰的氨基酸,即N端原則,當(dāng)下列氨基酸出現(xiàn)在N端時:蛋白的半衰期較短,蛋白會存在不穩(wěn)定降解的問題,當(dāng)它出現(xiàn)在第二個位置上時,蛋白極度不穩(wěn)定。
  重組人Flt3L采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法,用于體外定量分析人血清、血漿、細(xì)胞裂解液或細(xì)胞培養(yǎng)上清中Flt3L的含量。預(yù)先包被的抗體和檢測相抗體都是Flt3L單克隆抗體。檢測相抗體經(jīng)生物素標(biāo)記。隨后加入過氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng);在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人Flt3L呈正相關(guān)。
 

重組人Flt3L

 

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