Toxin代北京試劑

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1.2 方法

1.2.1 黃連水提液的制備

稱取干燥黃連 10 g，超微粉碎，加入 200 mL 的超純水，浸泡 2 h，大火煎

至煮沸后文火，保持 30 min，紗布過(guò)濾；藥渣加溫水 300 mL，再大火煎至煮沸

后文火煎 30 min，過(guò)濾，合并濾液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至 500 mL，10000 rpm

離心 15 min，離心取上清，定容至 100 mL，濃縮濃度為 100 mg·mL-1，用 0.22 μm

的除菌器過(guò)濾除菌，分裝 4℃冰箱保存。

1.2.2 高效液相色譜檢測(cè)黃連品質(zhì)

（1）色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4·6 mm，5 μm）；以乙腈—0.05 mol·L-1

磷酸二氫鉀溶液（50:50）（每 100 mL 中加十二垸基硫酸鈉 0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)

pH 值為 4.0）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為 345 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別稱表小檗堿 0.0018 g，黃連堿 0.0037 g，巴馬汀 0.0024 g，鹽酸小堿

0.002 g，置于 100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相定容，得表小檗堿濃度為 18 μg·mL-1，

黃連堿濃度為 37 μg·mL-1，巴馬汀濃度為 24 μg·mL-1，鹽酸小堿濃度為 20

μg·mL-1 的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液。再分別稀釋得到 7 個(gè)梯度的系列對(duì)照品溶液，進(jìn)高

效液相色譜儀測(cè)定，最后以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做四種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲

線。

（3）供試品溶液制備

水煮法制得黃連生藥濃度為 0.1 g·mL-1 的黃連溶液，再將該溶液在 12000 rpm

轉(zhuǎn)速下離心 20 min 除去不溶性雜質(zhì)，之后取上清液 1 mL 于 10 mL 容量瓶用流動(dòng)

相定容，再次用 12000 rpm 離心 15 min 除去不溶于流動(dòng)相的雜質(zhì)，最后用 0.22 μm

有機(jī)系濾膜過(guò)濾既得供試品溶液。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)

（1）細(xì)菌培養(yǎng) 將菌株置于 TSB 液體培養(yǎng)液中，37℃，130 rpm 恒溫培養(yǎng)振

蕩器中培養(yǎng)，待細(xì)菌長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

（2）細(xì)菌傳代 將長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)菌，2000 rpm 離心 3 min，棄上清，用 PBS

洗一次，離心，加入適量新鮮細(xì)菌培養(yǎng)液，重懸以適當(dāng)比例傳代接種到 50 mL

新鮮培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng)。

（3）細(xì)菌凍存 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，2000 rpm 離心 3 min，棄上清，用

PBS 洗一次，離心，新鮮的培養(yǎng)液懸浮，加等體積已備好的甘油水溶液，分裝于

1.5 mL 離心管中，標(biāo)明細(xì)菌株種類和凍存日期，置于-20℃冰箱中保存。

（4）細(xì)菌復(fù)蘇 從-20℃里取出凍存菌種，待其解凍，用接種環(huán)挑一環(huán)至已15

備好的固體培養(yǎng)基中，四區(qū)劃線后放于 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出

單菌落，用接種環(huán)挑取一個(gè)單菌落至新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行活化。

1.2.4 MIC 的檢測(cè)

（1）菌液的準(zhǔn)備 將凍存的痢疾桿菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)

蘇，待其有單菌落長(zhǎng)出，接種于已備好的新鮮、無(wú)菌胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）

培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，待其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用 TSB 液體培養(yǎng)基將痢疾桿菌濃度調(diào)

節(jié)至 105-106 cfu·mL-1。

（2）樣品準(zhǔn)備 配適當(dāng)體積的固體培養(yǎng)基高壓滅菌后加入一定體積的黃連水

提液，然后半倍稀釋，使其含藥培養(yǎng)基的濃度為 0、1.25、2.5、5、10、20 mg·mL-1，

倒入以備好的無(wú)菌平板中，每個(gè)平板中 5 mL 為宜，待其冷卻凝固之后，分別接

上以備好的菌懸液 50 μL 用涂菌器涂抹均勻，在 37℃的培養(yǎng)箱下進(jìn)行培養(yǎng)。

（3）樣品檢測(cè) 細(xì)菌檢測(cè) 24 h 后，觀察平板上菌種的生長(zhǎng)情況，以培養(yǎng)基

上無(wú)菌生長(zhǎng)的低濃度為黃連水提液的最小抑菌濃度。

1.2.5 痢疾桿菌生長(zhǎng)曲線

（1）藥物處理 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液

中黃連水提液的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，無(wú)菌水為空白

對(duì)照組，37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng)；

（2）準(zhǔn)備樣品 每隔 1 h 取各組樣品 2 mL，連續(xù)取 24 h；

（3）檢測(cè)樣品 用分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)為 600 的各組吸光度 OD 值，取 3

次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。繪制黃連水提液作用后痢疾桿菌的生長(zhǎng)曲線（OD 值為縱

坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)）。

1.2.6 培養(yǎng)液中 DNA、RNA 等大分子物質(zhì)的測(cè)定

（1）藥物處理 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液

中黃連水提液的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5mg·mL-1，10mg·mL-1，無(wú)菌水為空白對(duì)

照組，37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng)；

（2）樣品準(zhǔn)備 連續(xù) 12 h 取各組樣品 2 mL，離心 10 min，4000 rpm，棄沉

淀留上清。

（3）檢測(cè)樣品 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清液中 DNA、RNA 等大分子物質(zhì)

的吸光度值，波長(zhǎng) 260 nm。以無(wú)菌水為對(duì)照組，取 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.7 黃連對(duì)痢疾桿菌細(xì)胞壁的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的痢疾桿菌加入到含 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1

黃連的 TSB 液體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基含菌體 107 cfu·mL-1，于 37℃、130 rpm 搖

床培養(yǎng)，以無(wú)菌作為對(duì)照組，分別在 0、2、4、6、8、10 和 12 h 定時(shí)取樣 5000 rpm，16

10 min 離心取上清，上清液按照表 1 加入 96 孔板中。

用酶標(biāo)儀測(cè)定 96 孔板中各樣品在 520 nm 時(shí)的吸光度，并隨時(shí)間延長(zhǎng)檢測(cè)各

時(shí)間點(diǎn)的吸光度變化情況，平行測(cè)定 3 次取平均值。按照公式計(jì)算 AKP 的含量

（堿性磷酸酶（金氏單位/100 mL）=[（測(cè)定孔-空白孔）/（標(biāo)準(zhǔn)空-空白孔）]×

酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.02 mg·mL-1）×100 mL）

1.2.8 黃連對(duì)痢疾桿菌呼吸代謝系統(tǒng)的影響

（1）黃連處理 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的痢疾桿菌接種到新鮮培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)液

中黃連的終濃度為 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，無(wú)菌水為空白對(duì)照組，

37℃，130 rpm 搖床培養(yǎng) 10 h，每組設(shè)置三個(gè)平行；

（2）準(zhǔn)備樣品 將培養(yǎng)的菌液 5000 rpm 離心 10 min，棄去上清液，

（3）處理樣品 用 0.1 mol·L Tris-HCl（pH7.4）緩沖液洗菌沉淀 2-3 次后，

加入等體積的溶菌溶液，37℃水浴 20 min 后，立即冰浴，再加入 Tris-SDS

（pH=9.0）緩沖液 1 mL，10000 rpm 低溫離心 15 min，取出上清液；

（4）檢測(cè)樣品 酶活性的測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書操作。蛋白定量方法參照

Bradford 法

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