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抗生素問題

建議和解決方案

增加甘油原液的接種量通?？梢垣@得更好的質(zhì)粒產(chǎn)量。

質(zhì)粒上復(fù)制的起源可能固有不同類型的拷貝數(shù)。VectorBuilder生產(chǎn)的一些質(zhì)粒載體是中拷貝或低拷貝型，因此它們的質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制頻率低于高拷貝質(zhì)粒劑量。為了制備低拷貝質(zhì)粒，增加用于制備的大腸桿菌培養(yǎng)物的量，以獲得令人滿意的DNA產(chǎn)量。

在大腸桿菌培養(yǎng)中正確使用抗生素對于獲得高質(zhì)粒產(chǎn)量至關(guān)重要。首先，請仔細(xì)閱讀甘油儲備管上的標(biāo)簽，并確保你使用的是與質(zhì)粒上的抗生素耐藥性基因相對應(yīng)的抗菌藥物。濫用抗生素會抑制細(xì)菌繁殖。其次，一些抗生素，如氨芐青素，在液體培養(yǎng)中降解快。因此，不含質(zhì)粒的細(xì)菌可以繁殖到培養(yǎng)物的很大一部分，導(dǎo)致質(zhì)粒制劑的產(chǎn)量很低。為了避免這種情況，請在使用前新鮮制備含有氨西林的生長培養(yǎng)基，并確保提供足夠的氨西林。此外，當(dāng)培養(yǎng)氨西林抗性細(xì)菌時，不要讓液體培養(yǎng)物在收獲前很長時間飽和。

EndA'應(yīng)變

EndA*菌株保留了表達(dá)EndA核酸內(nèi)切酶的能力，這會導(dǎo)致質(zhì)粒制備產(chǎn)品中的質(zhì)粒DNA降解。要去除核酸內(nèi)切酶，請在DNA清除步驟中對質(zhì)粒制備柱進(jìn)行額外清洗，或者最好使用EndA菌株進(jìn)行克隆

微生物污染

如果你需要在沒有抗生素的環(huán)境中培養(yǎng)大腸桿菌，請非常小心，以免發(fā)生微生物污染。沒有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的微生物往往會更快地繁殖，并在細(xì)菌培養(yǎng)中占據(jù)主導(dǎo)地位，因為質(zhì)粒復(fù)制會消耗細(xì)胞分裂的能量。如果污染已經(jīng)發(fā)生，請用75%的乙醇清潔您的工作臺和軌道搖瓶。確保您的培養(yǎng)瓶和移液管端經(jīng)過良好消毒。你還需要用某些抗生素在瓊脂平板上篩選正確的菌株菌落。

噬菌體污染

噬菌體污染可能導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)中的細(xì)胞裂解。如果發(fā)生噬菌體污染，立即扔掉受污染的培養(yǎng)物，丟棄所有用于制備細(xì)菌培養(yǎng)物的溶液。用0.05%氫氧化鈉溶液仔細(xì)清潔工作臺表面和軌道振蕩器。所有用于細(xì)菌繁殖的培養(yǎng)瓶也應(yīng)通過浸泡法用氫氧化鈉溶液清洗，然后進(jìn)行高壓滅菌。同樣地具有fhuA突變的大腸桿菌菌株，如VB UitraStable“"化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，優(yōu)選用于克隆，因為它們對T1噬菌體表現(xiàn)出抗性。

序列對齊

確定兩個序列彼此之間的相似或不同程度是推斷兩個序列之間的結(jié)構(gòu)、功能或進(jìn)化關(guān)系的常用方法。VectorBuilder的序列比對工具不僅可以在DNA或蛋白質(zhì)水平上直接比較兩個序列，還可以基于翻譯比較兩個DNA序列。

比對提供了整個序列的同一性/相似性百分比的全局視角，以及比較單個核苷酸/氨基酸的重點視角。該工具利用間隙和間隙懲罰來最大限度地提高匹配兩個核苷酸或氨基酸的機(jī)會，同時保持?jǐn)?shù)據(jù)的完整性。雖然間隙說明了對齊序列中的插入或刪除，但間隙懲罰根據(jù)間隙的頻率和長度為對齊分配負(fù)分?jǐn)?shù)。

GC內(nèi)容計算器

DNA模板的GC含量是決定將靶基因成功克隆到所需主鏈中的關(guān)鍵因素。具有高GC含量的基因模板通常導(dǎo)致形成自二聚體或二級結(jié)構(gòu)的更高機(jī)會，并且需要更高的退火溫度。

該工具允許您確定整個基因序列以及基因內(nèi)特定區(qū)域的GC含量。當(dāng)輸入DNA或RNA序列時，計算每個堿基類型的數(shù)量和百分比。通過調(diào)整窗口大小，可以在圖形讀出中可視化序列中較小或較大片段的GC內(nèi)容。

DNA二級結(jié)構(gòu)

預(yù)測由轉(zhuǎn)錄的DNA形成的二級結(jié)構(gòu)在各種分子生物學(xué)技術(shù)中很重要，包括siRNA設(shè)計和克隆優(yōu)化。將您的序列粘貼到下面，并接收預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)的圖形輸出。自由能最小化用于確定堿基對之間的相互作用，突出潛在的莖和環(huán)的形成。

RNA二級結(jié)構(gòu)的形成

我們可以根據(jù)不同的組織水平來檢查細(xì)胞成分的活性。核酸或蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分別是核苷酸或氨基酸的基本序列。DNA的主要結(jié)構(gòu)是ATGC序列的列表。基于附近組分之間的相互作用，分子將形成其穩(wěn)定、低自由能的構(gòu)象。對于DNA來說，這種二級結(jié)構(gòu)是由兩條互補核苷酸的長鏈相互纏繞形成雙螺旋的結(jié)果。這兩個股線及其所得的二級結(jié)構(gòu)具有高水平的穩(wěn)定性。

然而，一旦被轉(zhuǎn)錄，RNA就會形成單鏈核苷酸。這種形式不太穩(wěn)定，核苷酸將尋求與互補核苷酸形成氫鍵：A與U，C與G，G與U。如果沒有像DNA中發(fā)現(xiàn)的互補鏈，單個RNA鏈將自身折疊成較低的

圖1。單鏈信使核糖核酸可以自我折疊形成二級結(jié)構(gòu)。

形成的二級結(jié)構(gòu)對RNA的功能有很大影響，無論是編碼還是非編碼，RNA結(jié)構(gòu)在基因功能和調(diào)控中都起著重要作用。確定這種結(jié)構(gòu)可以極大地幫助實驗設(shè)計和故障排除。我們的二級結(jié)構(gòu)工具提供了RNA鏈低自由能構(gòu)象的圖形布局。

用戶說明：甘油原液

檢索矢量信息

你的向量有一個未染色的向量lD，打印在甘油儲存管上。您可以通過VectorBullders主頁wectorbullder上的“Reteve Veccior informatlon"鏈接，使用thls lD來檢索矢量圖、矢量序列和矢量組件公告。

存儲

在溫和的溫度下，混合物以E，coll甘油原液（15%甘油）的形式存在。我們強烈建議您在冷凍vlal之前接種Le llquld培養(yǎng)基。在打開管子之前，請先做一次快速旋轉(zhuǎn)，以從ld中取出reslual llould，避免交叉污染。

arig

甘油原液可放入-80℃中長期保存。我們還建議您單獨制作甘油庫存作為備用。甘油散裝物應(yīng)僅放置在4’c短期儲存（2周）中。

接種

甘油原液來自單個克隆。你可以用它直接接種LB培養(yǎng)基。然而，在某些情況下，這種方法可能導(dǎo)致液體培養(yǎng)物的DNA yfeld較低。如果你連E，這個問題通常會消失。首先將菌落放在平板上，當(dāng)菌落全新鮮時，用一個菌落接種液體培養(yǎng)物。如果DNA含量低，請重新轉(zhuǎn)化，并克隆一個菌落接種新的lB菌株。如果你在后續(xù)工作中使用從原始甘油庫中提取的芥子菌集落，那么這個集落相對于母體庫獲得突變的可能性很小。因此，我們建議您在進(jìn)行進(jìn)一步的實驗之前，通過測序和限制性內(nèi)切酶來評估菌落（或幾個菌落）的正確性。

要從未冷凍的糖霜中接種，請將一微濾器的糖霜輕輕地滴入補充有適當(dāng)抗洗劑的混合液中。如果是從冷凍的甘油原液中接種的，用一個sterle plpette端刮下一小塊冷凍原液，然后小心地將端扔到llquld Le medlum中。你也可以先在LB平板上劃線，然后選擇一個菌落接種LB液體。

一些載體，特別是那些大小較大、序列重復(fù)或Gc含量異常的載體，可能有發(fā)生重排（如缺失）的趨勢。減少這種可能性的一種方法是在30℃的平板上培養(yǎng)大腸桿菌，并在培養(yǎng)基中代替標(biāo)準(zhǔn)的37℃。

抗生素濃度

打印在甘油儲備管上的載體ls的antblotic restance。請使用LB板或lg培養(yǎng)基中的抗菌劑，濃度如下。

Amplcllin:100μg/ml卡那素:50μg/ml

氯素：34微克/毫升

四環(huán)素：5微克/毫升

steptomycin:50ugiml

慶大素：10 pgiml

宿主菌株

請注意甘油儲備管上打印的大腸桿菌宿主菌株信息。大多數(shù)載體是在Stbl3宿主中構(gòu)建的，以確保序列的穩(wěn)定性。某些應(yīng)用程序需要使用其他主機(jī)。例如，來自pET載體的重組蛋白表達(dá)通常需要攜帶T7 RNA聚合酶基因的大腸桿菌宿主，如BL21（DE3），在這種情況下，來自Stbl3宿主的載體需要再轉(zhuǎn)化到合適的宿主中。

特別通知

VectorBuilder為我們構(gòu)建的載體提供100%的序列保證。如果您決定進(jìn)行獨立驗證，強烈建議使用Sanger測序，這是金標(biāo)準(zhǔn)分析。如果出現(xiàn)下一次操作測序（NGS或Nanopore seauencina）所稱的測序錯誤，請在聯(lián)系我們獲得售后支持之前仔細(xì)檢查buSanger測序的結(jié)果。我們最近注意到，在許多情況下，Nanopore測序的錯誤率很高。

疑難解答：質(zhì)粒DNA產(chǎn)量低

可能的原因

接種物太小

質(zhì)粒的拷貝數(shù)各不相同

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