用于前列腺癌光熱治療具有AIE特性超均質(zhì)NIR-II熒光自組裝納米探針

本文要點：近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像作為一種提供厘米級深度和微米級分辨率的成像技術，已引起人們的關注。然而，在兼顧體內(nèi)代謝的同時，制備出具有均勻尺寸、高生物等效能力和熒光強度的NIR-II熒光納米探針仍然是一個挑戰(zhàn)。本文中作者使用DSPE-PEG封裝具有AIE性質(zhì)的二區(qū)熒光分子構建出了一種具有優(yōu)異水溶性和生物安全性的超均質(zhì)NIR-II熒光納米探針。該納米探針具有高效的熱轉(zhuǎn)換效率和優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性，作者應用其進行NIR-II熒光成像，發(fā)現(xiàn)該納米探針可以在體內(nèi)有效代謝并在前列腺癌腫瘤組織中有效聚集，應用激光介導的光熱療法治療前列腺癌腫瘤時可以顯著抑制腫瘤組織的生長。此外，由于快速代謝，探針在體內(nèi)的滯留減少，有利于該探針的進一步臨床應用。最終，作者認為該納米探針在前列腺癌的準確診斷和治療方面具有廣泛的臨床應用潛力。

該納米熒光探針是一種新的基于NDI的NIR-II熒光納米探針，設計和制備示意圖如下（圖1）。

圖1：NIR-II納米探針的設計和制備示意圖。

為了制備具有良好水溶性和生物相容性的NIR-II熒光分子，作者使用DSPE-PEG對熒光分子進行封裝，以制備NIR-II納米探針。如透射電子顯微鏡圖所示（圖2c），在DSPE-PEG封裝后，獲得了NIR-II熒光納米探針（直徑：138.6±6.2 nm）。此外，NIR-II熒光分子以聚集的形式封裝在DSPE-PEG中，如冷凍電子顯微鏡圖所示（圖2d）。NIR-II納米探針的紫外-可見吸收光譜顯示在400–700 nm吸收帶處吸收波長為575nm（圖2e）。NIR-II分子的熒光發(fā)射光譜顯示，在THF溶液中在808nm激光激發(fā)下，發(fā)射波長峰值為1060nm（圖2f）。接下來，作者通過改變四氫呋喃（THF）/水混合物中的水分數(shù)（f w），研究了聚集狀態(tài)下基于NDI的NIR-II分子5的發(fā)射特性（圖2g）。隨著向THF中逐漸添加水，熒光強度降低，直到f w =48%，這可能是由于溶劑極性效應和由此產(chǎn)生的TICT狀態(tài)轉(zhuǎn)變。f w從48%增加到96%熒光發(fā)射強度逐漸增加，顯示出典型的AIE特征。AIE活性分子允許有效的固體/聚集發(fā)射（圖2h），這對生物醫(yī)學成像有用。為了檢測制備的納米探針的熱生產(chǎn)能力，作者使用近紅外熱成像來監(jiān)測探針在633nm激光照射下的熱轉(zhuǎn)換效率。在連續(xù)633nm輻射下，納米探針的溫度持續(xù)升高，240 s后達到60℃，而在類似條件下，去離子水的溫度僅達到38℃，表明納米探針具有高效的熱轉(zhuǎn)換效率（圖2i）。

接下來，基于該納米探針良好的生物相容性，作者進行了細胞攝取實驗，以觀察PC-3細胞對納米探針的攝取。在PC-3細胞與納米探針孵育1、6和12小時后，在細胞質(zhì)中觀察到來自納米探針的雙光子熒光，其中熒光強度隨孵育時間增加而增加，證明納米探針被PC-3細胞有效吸收（如圖3a和b）。接下來，將PC-3細胞與納米探針孵育12小時，并用633 nm激光照射6分鐘，隨后使用流式細胞術和活/死細胞雙重染色評估納米探針的治療效果。結(jié)果表明，在激光照射后（圖3c），納米探針組有58.5%的細胞出現(xiàn)早期，而PBS組為3.22%，與未輻射的PC-3細胞相比無顯著差異。流式細胞術結(jié)果通過活/死雙重染色進一步驗證。在沒有激光照射的情況下，PBS和納米探針組出現(xiàn)分散的死細胞（圖3d）。PBS組的死亡細胞數(shù)量在照射后沒有增加，但是，納米探針組的大多數(shù)細胞死亡，只有少數(shù)細胞存活。這些結(jié)果證實了納米探針在體外具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率。

圖3：（a）含有納米探針的PC-3細胞培養(yǎng)不同時間后的雙光子熒光顯微照片。（b）熒光信號強度統(tǒng)計分析。（c） PC-3細胞和納米探針孵育12h，然后進行633nm激光照射的流式細胞術分析（d）PC-3細胞與納米探針共孵育12小時，然后用633 nm激光照射（紅色熒光表示死細胞細胞核的PI染色，黃綠色熒光表示活細胞的細胞質(zhì)）的雙染色熒光顯微照片。

為了獲得理想的治療效果，必須在腫瘤組織中有效積累納米探針。因此，作者使用納米探針的NIR-II熒光成像來觀察它們在荷瘤小鼠腫瘤組織中的分布和代謝，以指導光熱治療。圖4a顯示了荷瘤小鼠NIR-II熒光的實時成像結(jié)果。盡管熒光信號在尾靜脈注射30分鐘后分布于荷瘤小鼠全身，但在肝臟中該信號明顯較弱，但在注射12小時后腫瘤組織中信號顯著增強。此外，注射后48小時，肝臟中的熒光信號進一步減弱，表明納米探針具有良好的腫瘤靶向特性，并且在肝臟中代謝。此外，我們還觀察了靜脈注射納米探針12和48小時后荷瘤小鼠主要器官和腫瘤組織中的體外熒光分布。這些熒光信號主要分布在血液供應豐富的器官，以及注射后12小時的肝臟和脾臟（圖4b和d），但注射后48小時顯著減少（圖4c和d）。然而，腫瘤組織中的熒光信號并未顯著減少，這表明納米探針不僅具有良好的腫瘤聚集特性，而且還可以被生物體有效代謝。

圖4：（a）經(jīng)尾靜脈注射納米探針后不同時間點PC-3荷瘤小鼠的NIR-II熒光圖像。（b）通過尾靜脈注射納米探針后12和48小時荷瘤小鼠主要器官和腫瘤組織的亮場圖像。（c）與圖像b對應的主要器官和腫瘤組織的NIR-II熒光圖像。（d）熒光信號強度的統(tǒng)計分析。

最后，作者在PC-3荷瘤小鼠上進行了633nm激光介導的光熱治療。荷瘤小鼠隨機分為四組：生理鹽水組；生理鹽水激光組；納米探針組；納米探針激光組。靜脈注射生理鹽水或納米探針用或不用激光照射腫瘤8min，在激光照射期間，通過近紅外熱像儀監(jiān)測腫瘤的溫度。納米探針組腫瘤部位的溫度顯著升高，降低激光照射（溫度達到43.6℃）。相比之下，生理鹽水組的體溫只升高了3.6°C，并且沒有增加到足以有效殺死腫瘤細胞的溫度（42°C）；（圖5a和b）。此外，納米探針激光照射組的腫瘤體積在激光照射后14天內(nèi)沒有增加；其他三組的腫瘤體積顯著增加（圖5c和d），表明納米探針注射結(jié)合激光治療的光熱療法顯著抑制腫瘤生長。此外，所有組的動物體重都具有可比性（圖5e），這表明光熱療法不會對動物造成任何明顯的毒性副作用。從各組收集治療小鼠的主要器官和腫瘤組織，切片，分別進行蘇木精和伊紅（H&E）染色和TUNEL免疫熒光染色。結(jié)果顯示，不同治療組動物的器官中沒有明顯的病理變化，如細胞水腫和壞死（圖5f）。H&E和TUNEL圖像顯示，經(jīng)納米探針和光熱療法治療的動物腫瘤組織中有大量死亡細胞，但在其他三個治療組的動物腫瘤中沒有。這些結(jié)果表明，光熱療法結(jié)合納米探針注射有效抑制腫瘤生長，具有高度的生物安全性。

圖5：納米探針在PC-3荷瘤小鼠體內(nèi)的光熱治療。（a）633nm激光照射各治療組荷瘤小鼠的近紅外熱成像。（b）不同組荷瘤小鼠腫瘤組織溫度變化的曲線。（c） 不同治療組小鼠腫瘤體積變化的數(shù)據(jù)（治療后21天）。（d）各治療組荷瘤小鼠腫瘤的照片（治療后21天）。（e）從每個治療組的荷瘤小鼠身上切除的腫瘤組織的數(shù)據(jù)。（f）各治療組荷瘤小鼠主要器官和腫瘤組織H&E染色和Ki-67免疫染色的圖像。

參考文獻

Cui Sheng sheng, Fan Shanshan, Tan Hai song, Lu Yi, Zha Yi qian, Xu Bin... & Cui Da xiang.(2021).Ultra-homogeneous NIR-II fluorescent self-assembled nanoprobe with AIE properties for photothermal therapy of prostate cancer.. Nanoscale(2021), doi:10.1039/D1NR04227K.

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