蛋白使用常見問題

1、蛋白為什么要凍干？凍干對蛋白的影響有哪些？
答：蛋白質(zhì)對熱敏感，凍干能使絕大部分蛋白質(zhì)的活性保留下來，提高蛋白的穩(wěn)定性并延長保存時間，同時降低運費。
凍干有可能會造成蛋白的活性部分損失，聚集和其它變性問題。但可以通過添加保護劑（穩(wěn)定劑，添加劑，輔料）和控制凍干的各種條件來盡可能降低這些負面的影響。
溫馨提示南京卡米洛提供的蛋白產(chǎn)品一般為凍干粉，它們在室溫條件下非常穩(wěn)定(至少1個月)。盡管如此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃ ，以確保蛋白100%的活性。
 
2、凍干前為什么向蛋白溶液中加保護劑？一般凍干保護劑有哪幾種？你們的產(chǎn)品通常加的保護劑是什么？
答：保護劑是用來在凍干和儲存過程中保護蛋白的。常用的保護劑或穩(wěn)定劑有糖類，多元醇，聚合物，表面活性劑，某些蛋白和氨基酸等。我們通常加8%（質(zhì)量比體積）的海藻糖和甘露醇作為凍干保護劑。海藻糖可明顯阻止蛋白質(zhì)二級結構改變以及凍干過程中蛋白質(zhì)的伸展和聚集；甘露醇也是一種普遍應用的凍干保護劑和填充劑，可以降低某些蛋白的凍干后聚集情況。
溫馨提示：對于大多數(shù)蛋白，重懸后在4℃僅能短期保存(約1周)。如想長期保存，請先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS)，然后分裝凍存于-20oC或-80oC。一定要避免反復凍融，因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。
 
3、為什么我的管內(nèi)幾乎看不見蛋白產(chǎn)品？
答：武漢華美的蛋白產(chǎn)品中不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等，并以少含鹽量的溶液進行凍干時，常常不能形成白色網(wǎng)架結構，而是微量的蛋白在凍干過程中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。
溫馨提示：在打開管蓋前，我們建議您在小離心機中快速離心20-30秒，使附著在管蓋或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準確無誤，雖然有時您無法看到蛋白粉末，但管中的蛋白含量仍是非常精確的。
 
4、應如何確定細胞因子的種屬交叉活性？
     答：1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細胞因子對小鼠細胞均有活性。2) 許多小鼠細胞因子也可作用于人類細胞，但比活性可能低于對應的人類細胞因子。 3) IL-7等為數(shù)不多的人類細胞因子作用于小鼠細胞時比對應的小鼠細胞因子活性更強。4) 干擾素，GM-CSF, IL-3和IL-4等細胞因子種屬特異，對非同源細胞幾乎沒有活性。5) 相反，成纖維細胞生長因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守，在不同動物種屬細胞上均具有很好的活性。
 
5、應如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品？ 
第1步：開蓋前離心試劑管。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉wanquan溶解。一般需要3000-3500rpm離心5min，效果良好。
第2步：用無菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。這個步驟即為溶解步驟，非常重要。
1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉。蛋白的溶解性與很多因素有關，其中比較重要的是pH值和離子強度。產(chǎn)品說明上所標明的溶解液是能夠將該細胞因子或重組蛋白wanquan溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強度與說明書中所標明的不符，很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能wanquan溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。
2) 一定要溶解到zhiding的濃度。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標明的濃度范圍，一般為0.1-1.0 mg/ml。但這一濃度范圍對于不同的重組蛋白是不同的。高于或低于該濃度范圍時細胞因子或蛋白會不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個濃度范圍，可能會超過該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無法wanquan溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結果還是部分蛋白未溶解，導致蛋白活性的減弱。
3) 一定不能振蕩(vortex)。這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。請用放至室溫的緩沖液作為溶劑。加緩沖液后，蓋好瓶塞，輕輕用手翻轉瓶子或把瓶子放在一個緩慢搖擺的搖床上。這樣做來保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個內(nèi)壁。 讓瓶子在室溫放置至少10 - 15分鐘，然后可以進行分裝或使用。
第3步：該重懸液在2-8oC最長可保存1周。
用說明書上推薦的溶液將細胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細胞因子或重組蛋白可放置在2-8oC，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細胞因子或重組蛋白的活性最長可保持1周。這對一個周期為5-7天的實驗，如DC(樹突狀細胞)的誘導成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
其實，說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在4oC保存，待1周內(nèi)用完。如進行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋，否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降，細胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
第4步：如要長期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20oC至-80oC。
如果一個實驗周期長于一周，或配制的細胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。方法是：將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進一步稀釋，然后分裝凍存于-20oC至-80oC，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。稀釋后的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
即在做無血清培養(yǎng)或動物的體內(nèi)實驗時，細胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動物或人的蛋白，要想長期保存細胞因子或重組蛋白則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。