細(xì)胞凋亡檢測(cè)

      細(xì)胞凋亡（apoptosis）指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。下面介紹幾種常用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。

     一、TUNEL法

      脫氧核糖核苷酸衍生物digoxin在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗digoxin抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，精確地定位出正在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。洋地黃植物是digoxin的原料來源，在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗digoxin抗體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低?？?/span>digoxin的特異性抗體與脊椎動(dòng)物非類固醇激素的交叉反應(yīng)不到1%，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可*排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

      在進(jìn)行TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中，需設(shè)置陽性和陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照的片子可使用DNase I部分降解的標(biāo)本，陽性細(xì)胞對(duì)照可使用地塞米松處理的大、小鼠胸腺細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞。陰性對(duì)照不加TdT酶，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同?，F(xiàn)在商品化的TUNEL試劑盒很多，可供選擇，除了DAB顯色法，還有熒光標(biāo)記等方法的試劑盒可以選擇，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的試劑盒來完成細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

     二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

     Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)：

     AO 可將細(xì)胞或細(xì)胞核中的雙鏈DNA 和變性DNA 染成不同顏色的熒光。AO 插入雙鏈DNA 中時(shí),發(fā)綠色熒光;AO也可與單鏈或通過變性而產(chǎn)生的DNA 單鏈發(fā)生作用,這時(shí)發(fā)出紅色熒光,因此,通過FCM 檢測(cè)不同的熒光,可判斷凋亡的發(fā)生。在測(cè)定被標(biāo)準(zhǔn)化后,綠色和紅色熒光強(qiáng)度的量與總DNA 含量成比例,紅色熒光與總體細(xì)胞(紅色加綠色) 熒光的比率表示細(xì)胞中變性DNA 的比例,因此,這種方法可用于評(píng)價(jià)DNA 對(duì)原位變性的敏感性。有時(shí)候,凋亡細(xì)胞DNA 降解不明顯,依賴于DNA 降解來檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法如細(xì)胞DNA含量測(cè)定、DNA 末端標(biāo)記等就難以檢測(cè)到細(xì)胞凋亡變化。AO法檢測(cè)凋亡的原理不依賴于DNA 片斷的產(chǎn)生,因此其最主要的優(yōu)點(diǎn)是可應(yīng)用于寡核小體片段與凋亡不相平衡等情況,但AO 染色法不能有效區(qū)分有絲分裂細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。

     若丹明( Rh123) 染色法：

     細(xì)胞生活狀態(tài)下,胞膜上的鈉- 鉀泵、鈣泵等的作用,使細(xì)胞膜內(nèi)外維持著不同離子的濃度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成細(xì)胞膜電位。FCM 可以檢測(cè)親脂性離子熒光染料在胞膜內(nèi)外的分布,來測(cè)量膜電位的高低,以評(píng)價(jià)細(xì)胞的活力。Rh123 是一種親脂性陽離子熒光染料,對(duì)細(xì)胞膜具有通透性,線粒體膜尤敏感。細(xì)胞存活狀態(tài)時(shí),若丹明123 通過細(xì)胞膜,積聚于線粒體發(fā)出綠色熒光。在細(xì)胞凋亡時(shí),線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降,電負(fù)性降低,故細(xì)胞線粒體積聚Rh123 的能力也喪失,熒光強(qiáng)度降低,據(jù)此檢測(cè)細(xì)胞的凋亡變化。但應(yīng)指出,在凋亡的早期階段,由于胞膜尚完整,大多數(shù)細(xì)胞器和細(xì)胞功能相對(duì)較好,因此,Rh123 法對(duì)于早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的鑒別比較困難。

     Annexin V-PI雙染色法：

     1992 年Fadok 報(bào)道在APO 早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserin ,PS) 遷移至細(xì)胞外側(cè),這一現(xiàn)象出現(xiàn)在核染色質(zhì)變性與核體積縮小之前。AnnexinV 是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高親合力,尤其與帶負(fù)電荷的磷脂如PS 具*的結(jié)合力,利用其特性可以檢測(cè)細(xì)胞凋亡。但壞死細(xì)胞PS 亦暴露于外表使Annexin V 結(jié)合陽性,因此使用Annexin V 這一參數(shù)不能區(qū)分壞死或凋亡,必須同時(shí)采用PI 這一參數(shù)將壞死細(xì)膽區(qū)分開來。FCM 通過Annexin V —FITC 標(biāo)志暴露于細(xì)胞膜上的PS 結(jié)合PI 進(jìn)入損傷細(xì)胞膜標(biāo)記降解DNA 分析凋亡與壞死細(xì)胞。在檢測(cè)時(shí)有4個(gè)亞群包括機(jī)械性損傷細(xì)胞(Annexin - / P1 + ) 、正常細(xì)胞(An2nexin - / PI - ) 、凋亡細(xì)胞(Annexin + / PI - ) 和繼發(fā)性壞死細(xì)胞(Annexin + / PI + ) 被區(qū)分。Boersma 等應(yīng)用Ampexin V2FITE染色法檢測(cè)細(xì)胞處理后的中國倉鼠細(xì)胞凋亡變化,FCM 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)強(qiáng)弱不同的兩種細(xì)胞亞群。進(jìn)一步形態(tài)學(xué)等證實(shí)弱熒光細(xì)胞亞群代表早期凋亡細(xì)胞,強(qiáng)熒光亞群代表晚期凋亡細(xì)胞,可見其是檢測(cè)和定量凋亡細(xì)胞的一種較為可靠的方法。細(xì)胞凋亡時(shí)膜上PS 外露早于DNA 斷裂發(fā)生,因此該法檢測(cè)早期凋亡更為靈敏,且該法不需要固定細(xì)胞,避免了PI 法因固定造成的細(xì)胞碎片過多及TUNEL 法因固定出現(xiàn)的DNA 片段丟失,因此更加省時(shí),結(jié)果亦更可靠,是目前最為理想的凋亡定量檢測(cè)方法。

儀器推薦：CO2培養(yǎng)箱