RNA免疫共沉淀技術(shù)

        RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP ）是一種基于抗體的技術(shù)，用于定位體內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)相互作用。將所關(guān)注的RNA結(jié)合蛋白(RBP)與其結(jié)合的RNA一起進(jìn)行免疫沉淀，鑒定結(jié)合轉(zhuǎn)錄RNA（mRNA、非編碼 RNA或病毒RNA），可以通過(guò)實(shí)時(shí)PCR、微陣列或測(cè)序檢測(cè)。表觀遺傳學(xué)和RNA生物學(xué)領(lǐng)域?qū)Σ煌琑NA作用和功能的關(guān)注大大增加。據(jù)觀察，RNA的功能遠(yuǎn)不止轉(zhuǎn)錄和后續(xù)的翻譯。例如，RNA-蛋白質(zhì)相互作用能夠調(diào)控mRNA和非編碼RNA的功能。對(duì)RNA潛能的這一新認(rèn)識(shí)帶動(dòng)了新方法的發(fā)展，使研究人員能夠定位 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。RIP是一種研究單個(gè)蛋白質(zhì)和 RNA 分子間物理結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方案。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.裂解組織/細(xì)胞（使用甲醛選擇性處理細(xì)胞，體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)-RNA 復(fù)合物）。

2.分離細(xì)胞核，裂解細(xì)胞核沉淀。

3.染色質(zhì)片段化。

4.將所關(guān)注的 RNA 結(jié)合蛋白 (RBP) 和結(jié)合的 RNA 一起進(jìn)行免疫沉淀。

5.洗去未結(jié)合的物質(zhì)，純化免疫沉淀后 RBP 上結(jié)合的 RNA。

6.RNA鑒定，通過(guò) qPCR、微陣列或測(cè)序進(jìn)行。

7.結(jié)果判讀。RIP實(shí)驗(yàn)通常分為三組：Input組，IgG組和目的蛋白組。分析RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即檢測(cè)目的蛋白能夠結(jié)合的RNA含量，IgG組作為背景RNA含量的參照。結(jié)果分析方法為：將目的蛋白組中結(jié)合的RNA檢測(cè)值與IgG組結(jié)合的RNA檢測(cè)值相比，作為目的蛋白結(jié)合RNA的相對(duì)值。我們認(rèn)為，比IgG組結(jié)合量多的即為陽(yáng)性結(jié)合，與IgG組結(jié)合量無(wú)差異或結(jié)合量少的即為不結(jié)合。

注意事項(xiàng)：

1.在裂解細(xì)胞的時(shí)候，瞬時(shí)凍融能夠使裂解更加充分，但是多次反復(fù)凍融則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)和RNA的裂解。

2.實(shí)驗(yàn)分組中，IgG組用來(lái)作為衡量RNA非特異結(jié)合背景含量的參考，而選擇IgG時(shí)應(yīng)注意亞型要與目的蛋白抗體的亞型*一致?？贵w包裹Protein-A/G時(shí)，使用的IgG濃度必須與目的蛋白抗體含量*一致。

3.在Protein-A/G清洗步驟中，充分*的洗滌非常重要，因此加入適量的尿素、SDS以提升實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性。

4.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)在冰上進(jìn)行，以防止蛋白質(zhì)和RNA的降解。RNase-free的耗材的使用是需要的，避免RNA的降解。

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