RNA免疫共沉淀技術(shù)

        RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP ）是一種基于抗體的技術(shù)，用于定位體內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)相互作用。將所關(guān)注的RNA結(jié)合蛋白(RBP)與其結(jié)合的RNA一起進行免疫沉淀，鑒定結(jié)合轉(zhuǎn)錄RNA（mRNA、非編碼 RNA或病毒RNA），可以通過實時PCR、微陣列或測序檢測。表觀遺傳學和RNA生物學領(lǐng)域?qū)Σ煌琑NA作用和功能的關(guān)注大大增加。據(jù)觀察，RNA的功能遠不止轉(zhuǎn)錄和后續(xù)的翻譯。例如，RNA-蛋白質(zhì)相互作用能夠調(diào)控mRNA和非編碼RNA的功能。對RNA潛能的這一新認識帶動了新方法的發(fā)展，使研究人員能夠定位 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。RIP是一種研究單個蛋白質(zhì)和 RNA 分子間物理結(jié)合的實驗方案。

實驗步驟：

1.裂解組織/細胞（使用甲醛選擇性處理細胞，體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)-RNA 復合物）。

2.分離細胞核，裂解細胞核沉淀。

3.染色質(zhì)片段化。

4.將所關(guān)注的 RNA 結(jié)合蛋白 (RBP) 和結(jié)合的 RNA 一起進行免疫沉淀。

5.洗去未結(jié)合的物質(zhì)，純化免疫沉淀后 RBP 上結(jié)合的 RNA。

6.RNA鑒定，通過 qPCR、微陣列或測序進行。

7.結(jié)果判讀。RIP實驗通常分為三組：Input組，IgG組和目的蛋白組。分析RIP實驗結(jié)果，即檢測目的蛋白能夠結(jié)合的RNA含量，IgG組作為背景RNA含量的參照。結(jié)果分析方法為：將目的蛋白組中結(jié)合的RNA檢測值與IgG組結(jié)合的RNA檢測值相比，作為目的蛋白結(jié)合RNA的相對值。我們認為，比IgG組結(jié)合量多的即為陽性結(jié)合，與IgG組結(jié)合量無差異或結(jié)合量少的即為不結(jié)合。

注意事項：

1.在裂解細胞的時候，瞬時凍融能夠使裂解更加充分，但是多次反復凍融則會導致蛋白質(zhì)和RNA的裂解。

2.實驗分組中，IgG組用來作為衡量RNA非特異結(jié)合背景含量的參考，而選擇IgG時應(yīng)注意亞型要與目的蛋白抗體的亞型*一致?？贵w包裹Protein-A/G時，使用的IgG濃度必須與目的蛋白抗體含量*一致。

3.在Protein-A/G清洗步驟中，充分*的洗滌非常重要，因此加入適量的尿素、SDS以提升實驗的嚴謹性。

4.實驗操作過程應(yīng)在冰上進行，以防止蛋白質(zhì)和RNA的降解。RNase-free的耗材的使用是需要的，避免RNA的降解。

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