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Cell Counting Kit-8

 Catalog Number：P11110

01/產(chǎn)品概述

       LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110，簡稱CCK-8或CCK8試劑盒，是一種基于WST-8（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒，是MTT、XTT、MTS等的優(yōu)良替代方法。

　　WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan(圖1)。對(duì)于相同起始量的細(xì)胞，細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同種細(xì)胞，顏色的深淺(生成的formazan量)與細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系(圖3)。

圖1.WST-8檢測原理圖（EC=electroncouplingreagent，即電子耦合試劑）

    　WST-8是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)：

　　(1)MTT被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液來溶解，而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。

　　(2)WST-8比XTT、MTS更加穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。

　　(3)WST-8和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。

　　LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110為即用型試劑，使用方法十分便捷，無須再進(jìn)行任何配制等操作，無須使用同位素，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔板內(nèi)即可完成。不必洗滌細(xì)胞，不必收集細(xì)胞，也不必采用額外的步驟溶解formazan，可以用于大批量樣品的檢測。同時(shí)，WST-8對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，加入CCK-8溶液顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀板，使檢測時(shí)間更加靈活，便于找到最佳測定時(shí)間。LeapWalCellCountingKit-8CCK-8可以應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長抑制檢測、毒性測定、藥物篩選、腫瘤藥敏等試驗(yàn)。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

       冰袋（wetice）運(yùn)輸。4℃避光保存，有效期12個(gè)月。-20℃避光保存，有效期24個(gè)月。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

　　即用型試劑，無須再進(jìn)行任何試劑的配制

　　對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，檢測時(shí)間更加靈活，可在不同時(shí)間點(diǎn)反復(fù)/連續(xù)讀值

　　顯色穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠

　　線性范圍寬，靈敏度高

　　可用于大批量樣品的檢測

05/實(shí)驗(yàn)流程概要

06/實(shí)驗(yàn)步驟

一.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是試驗(yàn)條件*一致）

　　1.先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞；

　　2.按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般需要做5-7個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組4-6個(gè)復(fù)孔；

　　3.接種后培養(yǎng)4-6小時(shí)使細(xì)胞貼壁（懸浮細(xì)胞可省略此步驟）；

　　4.加入LeapWal Cell Counting Kit-8試劑（每100μL培養(yǎng)基加10μLCCK-8）。培養(yǎng)一定時(shí)間（0.5-4小時(shí)）后測定OD450，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，OD450為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量。

二.細(xì)胞活性檢測

　　1.在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔），將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)16-24小時(shí)；

　　2.向每孔中加入10μLCCK-8溶液，切勿產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)影響OD值的讀數(shù)；

　　3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-4小時(shí)；

　　4.用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度。

三.細(xì)胞增殖-毒性檢測

　　1.在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔），將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)16-24小時(shí)；

　　2.向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物（依據(jù)實(shí)驗(yàn)者具體方案而定）；

　　3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一段時(shí)間（依據(jù)實(shí)驗(yàn)者具體方案而定）；

　　4.向每孔加入10μLCCK-8溶液，切勿產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)影響OD值的讀數(shù)；

　　5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育0.5-4小時(shí)；

　　6.用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度。

　　?如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性，可在加入CCK-8之前，棄去舊培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基，來去除藥物的影響。當(dāng)藥物影響較小時(shí)，也可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白對(duì)照孔的吸光度值即可。

07/計(jì)算公式

　　細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

　　抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%

　　As:實(shí)驗(yàn)孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液）

　　Ac:對(duì)照孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含藥物）

　　Ab:空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含細(xì)胞、藥物）

08/適用范圍

　　1.細(xì)胞增殖測定：CCK-8是水溶性的，在培養(yǎng)基中穩(wěn)定且無毒。

　　2.細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性分析：代謝活性以及染料的形成與細(xì)胞的活性和損傷成比例。

　　3.細(xì)胞因子分析：測定細(xì)胞因子誘導(dǎo)的增殖，必要時(shí)，可在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)回收和擴(kuò)增細(xì)胞。

09/注意事項(xiàng)

　　1.使用96孔板進(jìn)行檢測時(shí)，需考慮液體蒸發(fā)問題。由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，建議棄用周圍一圈，改加等量的PBS、水或培養(yǎng)液。

　　2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)建議每孔加入100μL2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100μL5000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞大小、細(xì)胞增殖速度等因素決定）。按照實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行培養(yǎng)并給予0-10μL特定的藥物刺激。

　　3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，還原劑（例如，抗氧化劑）會(huì)干擾檢測結(jié)果，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。

　　4.測試藥物如含有金屬，對(duì)CCK-8顯色會(huì)有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%，15%，90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM，將會(huì)100%抑制，需設(shè)法去除。

　　5.培養(yǎng)基中的酚紅不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測造成影響。

　　6.檢測時(shí)，如果起始培養(yǎng)體積為100μL，每孔加入10μLCCK-8溶液。如果起始培養(yǎng)體積為200μL，則需加入20μLCCK-8溶液，其它情況以此類推?？梢杂眉恿讼鄳?yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。如果擔(dān)心所使用的藥物會(huì)干擾檢測，需設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。

　　7.CCK-8的培養(yǎng)時(shí)間一般為0.5-4小時(shí)，對(duì)于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)即可。孵育時(shí)間的長短需根據(jù)細(xì)胞類型和細(xì)胞密度等實(shí)驗(yàn)情況而定，需要摸索條件，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

　　8.在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長，例如650nm，作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。

　　9.酶標(biāo)儀檢測前需確保孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測定結(jié)果。

　　10.需要測定細(xì)胞的具體數(shù)量時(shí)，建議同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　11.若檢測樣本較多，建議采用多通道移液器，以減小工作量及平行孔間的差異。

　　12.以下方法可以終止CCK-8反應(yīng)(96孔板):(a)顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置于4℃冰箱內(nèi)。(b)每孔加入10μL0.1MHCl溶液。(c)每孔加入10μL1%(w/v)SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)測定。

　　13.為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)。

　　14.本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

10/實(shí)驗(yàn)案例分析

　　1.將不同數(shù)量的HeLa細(xì)胞按照每孔100μL培養(yǎng)液接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞充分貼壁，每孔加入10μLCCK-8溶液。

　　2.孵育1小時(shí)后測定450nm的吸光度值，檢測結(jié)果如圖3所示。（檢測結(jié)果僅供參考，實(shí)測數(shù)據(jù)會(huì)因檢測儀器等的不同而存在差異）

圖3: CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞活性