谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說明書
分光光度法 50 管/24 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：
GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷氨酸合成谷
氨酰胺，不僅可以防止過多的銨離子對(duì)生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲(chǔ)存和運(yùn)輸形式。
測定原理：
GS 在ATP 和Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨酰基異羥肟酸，在酸性條件下形成的絡(luò)合物在 540nm 處有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測定。
組成：
產(chǎn)品名稱 | BH6001-50T/24S | Storage |
提取液 | 30ml | 4℃ |
試劑一：液體 | 12ml | -20℃ |
試劑二：液體 | 12ml | -20℃ |
試劑三：粉劑 | 2 瓶 | -20℃ |
試劑四：液體 | 15ml | 4℃ |
說明書 | 1 份 |
試劑一臨用前 37℃預(yù)熱 20min，充分混勻，如有沉淀，靜置 10min，取上清待用。試劑二臨用前 37℃預(yù)熱 20min，充分混勻，如有沉淀，靜置 10min，取上清待用。試劑三用時(shí)每瓶加入 5ml 蒸餾水充分溶解待用。
自備儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
樣本測定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、在EP 管中加入下列試劑：
試劑名稱（μl） | 測定管 | 對(duì)照管 |
試劑一 | 400 |
|
試劑二 |
| 400 |
試劑三 | 175 | 175 |
樣本 | 175 | 175 |
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 30min
混勻，25℃室溫靜置 10min 后，5000g，25℃離心 10min，取上清液測定 540nm 處的吸光值A。△A=A
測定管-A 對(duì)照管。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
GS 活力單位的計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.8348x + 0.0008，R2 = 0.9999
1、血清（漿）GS 活性
單位定義：每ml 血清（漿）在每ml 反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。
計(jì)算公式：
GS（μmol/h/ml）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷V 樣÷T=10.268×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 GS 活性
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白在每ml 反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g 組織在每ml 反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=10.268×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每ml 反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生 1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。
GS（μmol/h/104 cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T
=0.021×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.75ml； V 樣：加入樣本體積，0.175ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml； T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。
