簡化基因組甲基化測序（RRBS/ dRRBS）

大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年的易基因。

簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切，富集啟動(dòng)子及CpG島等重要的表觀調(diào)控區(qū)域并進(jìn)行重亞硫酸鹽測序。該技術(shù)顯著提高了高CpG區(qū)域的測序深度，在CpG島、啟動(dòng)子區(qū)域和增強(qiáng)子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

為適應(yīng)科研技術(shù)的需要，易基因進(jìn)一步開發(fā)了可在更大區(qū)域內(nèi)捕獲CpG位點(diǎn)的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。

為助力適用低起始量DNA樣本（5ng）量多維度甲基化分析，易基因開發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化靶向基因組測序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和微量樣本復(fù)用檢測，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個(gè)細(xì)胞基因組CG位點(diǎn)覆蓋高達(dá)15M以上。

1、起始量：100ng gDNA；

2、單堿基分辨率；

3、多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性可達(dá)到85%-95%、測序區(qū)域針對高CpG調(diào)控區(qū)域，數(shù)據(jù)利用率更高；

4、針對性強(qiáng)，成本較低；

5、基因組CG位點(diǎn)覆蓋高達(dá)10-15M，顯著優(yōu)于850K芯片。

RRBS/dRRBS/XRBS廣泛應(yīng)用于動(dòng)物，要求全基因組掃描（覆蓋關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)）的：

• 列研究、疾病分子分型、臨床樣本的甲基化 Biomarker 篩選

• 復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)病機(jī)制等甲基化研究

• 模式動(dòng)物發(fā)育和疾病甲基化研究

背 景：

早產(chǎn)后，未成熟的腸道功能和免疫功能必須迅速適應(yīng)細(xì)菌定植和腸內(nèi)喂養(yǎng)。但未成熟腸道的較佳飲食策略（如時(shí)間、飲食量和飲食類型）和最合適的細(xì)菌定植仍然未知。需要更好地理解未成熟腸道如何與環(huán)境因素（如營養(yǎng)和微生物）相互作用，以確定如何能確保早產(chǎn)兒對產(chǎn)后生活適應(yīng)的早期喂養(yǎng)策略。

方 法：

作者為驗(yàn)證腸道表觀遺傳變化與早產(chǎn)及第1次喂養(yǎng)時(shí)的腸道反應(yīng)有關(guān)，以仔豬為模型，對早產(chǎn)豬和足月豬進(jìn)行全腸外營養(yǎng)（TPN）或部分腸內(nèi)喂養(yǎng)5天，然后用牛奶進(jìn)行純腸內(nèi)喂養(yǎng)，直到第26天（斷奶年齡）。在第0天、第5天和第26天從總共10組豬中收集腸組織，比較分析早產(chǎn)豬和足月豬的腸道結(jié)構(gòu)、功能、微生物組、DNA甲基化和基因表達(dá)（每組n=8）。

結(jié) 論：

RRBS結(jié)果顯示，出生時(shí)早產(chǎn)豬腸道出現(xiàn)絨毛縮短和整體高甲基化，影響與Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因。在生命的前5天，高甲基化相關(guān)的LBP（lipopolysaccharide binding protein）和TLR4（Toll-like receptor 4）通路基因表達(dá)明顯降低，但大多數(shù)早期甲基化差異在第26天消失。直到第26天，早產(chǎn)豬的蔗糖酶和麥芽糖酶活性仍然降低，腸道微生物群發(fā)生改變。0-5天期間顯示許多新的甲基化差異，主要表現(xiàn)在未提供腸內(nèi)喂養(yǎng)（TPN喂養(yǎng)）的情況下。這些甲基化差異影響了與細(xì)胞代謝相關(guān)的腸道基因，包括通過啟動(dòng)子低甲基化增加GCK（葡萄糖激酶）表達(dá)?？傊?，未成熟腸道在早產(chǎn)后可迅速適應(yīng)其基因甲基化和表達(dá)的能力，只有少數(shù)早產(chǎn)相關(guān)缺陷會(huì)持續(xù)到斷奶。結(jié)果表明早期腸內(nèi)喂養(yǎng)對于刺激腸道基因甲基化重編程可能很重要，從而使腸道快速適應(yīng)早產(chǎn)環(huán)境。

背 景：

孵化過程中的溫度和CO2濃度對肉雞的發(fā)育有著深遠(yuǎn)的影響。此前許多研究發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)的差異對孵化心重 (heart weight，HW) 有顯著影響。早期生活環(huán)境也被證明會(huì)影響肉雞后期的生產(chǎn)性能，因此表觀遺傳機(jī)制可能介導(dǎo)環(huán)境刺激引起的長期生理變化。

方 法：

利用RRBS技術(shù)評(píng)估84只在兩種不同蛋殼溫度（EST；37.8℃和38.9℃）和三種CO2濃度（0.1%、0.4%和0.8%）下孵化的肉雞幼體心臟組織的DNA甲基化模式，并進(jìn)行差異甲基化分析。

結(jié) 論：

本研究利用RRBS技術(shù)驗(yàn)證了ABLIM2、PITX2和THRSP三個(gè)基因的甲基化和表達(dá)的協(xié)調(diào)變化，確定孵化后小雞心臟的差異甲基化模式與孵化EST和CO2的差異有關(guān)，并且這種差異可能通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和基因表達(dá)的變化影響心臟的生長和發(fā)育。此外，本研究還鑒定了負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)體溫的其他器官（包括下丘腦和甲狀腺）的表觀遺傳模式可能有助于表征調(diào)節(jié)心臟發(fā)育的溫度驅(qū)動(dòng)差異機(jī)制?？傊?，對早期生活環(huán)境影響的表觀遺傳特征了解可以作為未來動(dòng)物表現(xiàn)預(yù)測因子，從而有利于動(dòng)物育種。

參考文獻(xiàn)：

① Gao F,et al.Rapid Gut Adaptation to Preterm Birth Involves Feeding-Related DNA Methylation Reprogramming of Intestinal Genes in Pigs. Front Immunol. 2020;11:565.

② Corbett RJ, et al. Genome-Wide Assessment of DNA Methylation in Chicken Cardiac Tissue Exposed to Different Incubation Temperatures and CO2 Levels. Front Genet. 2020;11:558189.