61HI2TLB HTRF MAB ANTI-6HIS TB GOLD

檢測原理：在 HTRF 相互作用檢測中，一部分（直接或間接）用供體標(biāo)記，另一部分用受體標(biāo)記（同樣直接或間接）。信號(hào)強(qiáng)度與兩部分的結(jié)合成正比。在此處所示的例子中：單克隆抗體 Anti-6HIS Tb Gold 與帶 6 個(gè)標(biāo)簽的A部分 結(jié)合，而 B部分 * 與用 HTRF 受體標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合。*  B部分 也可以是化的、帶標(biāo)簽的、Fc 融合的。在這些情況下，使用相應(yīng)的用受體標(biāo)記的 HTRF 試劑（抗標(biāo)簽、抗物種、蛋白 A、鏈霉親和素）進(jìn)行檢測。

檢測方案：右側(cè)的例子描述了使用 20µL 最終檢測體積來檢測帶 6 個(gè)標(biāo)簽的A部分 和未帶標(biāo)簽的 B部分* 之間相互作用的方案。分配兩個(gè)部分（10µL），孵育，加入單克隆抗體 Anti-6HIS Tb Gold（5µL）和用受體標(biāo)記的抗B部分（5µL），孵育并讀取。* B部分也可以是化的、帶標(biāo)簽的、Fc 融合的或直接標(biāo)記的。在這些情況下，使用相應(yīng)的用受體標(biāo)記的 HTRF 試劑（抗標(biāo)簽、抗物種、蛋白 A、鏈霉親和素）進(jìn)行檢測。

檢測細(xì)節(jié)：

1. 測試次數(shù)與活性部分的關(guān)系：每孔的平均結(jié)合物數(shù)量反映了總體生物材料含量。通常優(yōu)選使用活性部分的量而不是總結(jié)合物的量。對(duì)于穴狀化合物和 d2 結(jié)合物，總結(jié)合物的量等于活性部分的量，因?yàn)闃?biāo)記的分子量可以忽略不計(jì)。對(duì)于用 XL665 標(biāo)記的實(shí)體，總結(jié)合物的量將根據(jù) XL665 結(jié)合物的最終摩爾比而變化，然而，Revvity 提供的活性部分的量是恒定的，并且基于訂購的測試次數(shù)。

2. 推薦的穴狀化合物和 XL665 結(jié)合物的量：穴狀化合物結(jié)合物不能過量，以防止讀數(shù)器飽和和不可接受的背景水平。在大多數(shù)情況下，1 到 5nM 的穴狀化合物濃度是合適的，并且根據(jù)所使用的與 HTRF 兼容的讀數(shù)器，在 620nm 處將產(chǎn)生 20,000 到 80,000 cps。XL665 結(jié)合物必須盡可能與其檢測對(duì)應(yīng)物匹配，以便最大數(shù)量的生物分子被 XL665 受體標(biāo)記。因此，要檢測濃度為 20nM 的帶標(biāo)簽分子，抗標(biāo)簽 - XL665 的濃度應(yīng)是等摩爾或更高。

檢測驗(yàn)證：

銪與鋱抗體用于鑒定分子相互作用：根據(jù)標(biāo)簽位置的不同，檢測性能可能因蛋白而異。這里描述了不同的 Revvity 抗 6His 結(jié)合物（銪、鋱、銪 Gold、鋱 Gold）和 Lanthascreen 抗 His 標(biāo)簽抗體（銪、鋱）的并行使用。這些情況表明，根據(jù)所研究的相互作用，可能需要使用不同的抗體：在一種情況下，基于銪的抗體表現(xiàn)良好，而在另一種情況下，鋱顯示出更好的結(jié)果。對(duì)于下面測試的每個(gè)相互作用，Revvity Anti 6His Gold 結(jié)合物的性能優(yōu)于 Lanthascreen Anti-6His 標(biāo)簽抗體。

BRD4 (1)-H4 肽相互作用的檢測原理：帶 6 個(gè)標(biāo)簽的 BRD4 (1) 閱讀結(jié)構(gòu)域與化肽底物 H4 的結(jié)合通過結(jié)合物混合物檢測：針對(duì) 6His 標(biāo)簽的供體穴狀化合物標(biāo)記抗體和用于檢測化肽的 SA-XL665。

確定最佳 H4 肽濃度：肽滴定的第一步顯示，使用 Lanthascreen 銪或鋱抗體供體時(shí)無法檢測到（鋱標(biāo)記的數(shù)據(jù)未顯示）。對(duì)于這些，不能考慮進(jìn)一步的化合物篩選。然而，Revvity 的 Gold 版本和經(jīng)典版本的抗 6His 抗體都能夠檢測到相互作用。使用 Gold 版本增加了檢測窗口。

JQ1 對(duì) BRD4-H4 相互作用的抑制作用：JQ1 抑制劑的 IC50 在 12 到 24.5nM 之間，與文獻(xiàn)一致。正如預(yù)期的那樣，新的 Anti-6His 穴狀化合物 Gold 顯示出增加的檢測窗口。

NEFcore/Hck (SH3 結(jié)構(gòu)域) 蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用的檢測原理：NEFcore HcK SH3 結(jié)構(gòu)域相互作用是 HIV 傳染病的一個(gè)重要目標(biāo)。這種相互作用的抑制劑是重要的目標(biāo)，并被認(rèn)為是治療解決方案。帶有 GST 標(biāo)簽的 NEFcore 使用 Revvity PPI MAb Anti GST-d2 抗體在 3nM 下檢測。含有 6His 標(biāo)簽的 HcK SH3 結(jié)構(gòu)域使用 Anti 6His Gold 供體結(jié)合物檢測。

確定最佳 GST-Nef 濃度：當(dāng)使用 Revvity Anti-6His Tb 穴狀化合物時(shí)無法檢測到（使用銪時(shí)觀察到相同的結(jié)果，數(shù)據(jù)未顯示），Gold 版本顯示出檢測窗口的顯著增加，使得能夠進(jìn)一步篩選這種蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用。結(jié)果優(yōu)于使用 Lanthascreen Tb 抗 His 標(biāo)簽抗體獲得的結(jié)果（對(duì)于銪也是相同的結(jié)論，數(shù)據(jù)未顯示）。

FynSH3 對(duì) NEFcore/Hck (SH3 結(jié)構(gòu)域) 相互作用的抑制作用：使用 FynSH3 蛋白進(jìn)行抑制劑篩選測定，它與 Nef Core 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，與 HcK SH3 結(jié)構(gòu)域競爭。這顯示出 IC50 為 0.7 - 2µM。使用 Revvity Anti-6His Tb 穴狀化合物時(shí)檢測窗口略好。