1. 使用三重四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行蛋白藥物定量的方法開(kāi)發(fā)流程

使用質(zhì)譜進(jìn)行蛋白藥物定量，在方法開(kāi)發(fā)時(shí)主要考慮樣品前處理和質(zhì)譜方法兩個(gè)主要方面。在前處理方面我們使用了去垢劑輔助沉淀酶解的方法來(lái)獲得更佳的酶解效率和更低的基質(zhì)效應(yīng)，具體步驟如圖1a所示。蛋白類藥物質(zhì)譜定量時(shí)一般采用bottom-up的策略，因此整個(gè)質(zhì)譜方法的開(kāi)發(fā)主要包括候選肽段挑選，質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化（Compound Optimization）和離子對(duì)精簡(jiǎn)（Re-nement）三個(gè)步驟（圖1b）。

● 候選肽段挑選

一般來(lái)說(shuō)，我們挑選的候選肽段需要滿足以下條件: (1) 該肽段在基質(zhì)樣品不存在*相同的序列，在實(shí)際工作中，這一步通常需要放到最后的re-nement步驟完成評(píng)估。(2) 肽段的長(zhǎng)度在7-20個(gè)氨基酸為宜, 太短的肽段特異性較差，而太長(zhǎng)的肽段通常色譜質(zhì)譜行為不佳，給方法開(kāi)發(fā)帶來(lái)困難。(3) 沒(méi)有漏切位點(diǎn)。(4) 不含M, C, KP/RP, HxS/T等氨基酸或者一致序列。(5) 該肽段質(zhì)譜響應(yīng)高。由于三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀不具備數(shù)據(jù)依賴采集（Data-dependent Acquisition, DDA）的功能來(lái)對(duì)蛋白藥物進(jìn)行肽圖分析，因此在進(jìn)行候選肽段挑選時(shí)通常依賴于軟件預(yù)測(cè)的方法[8]。然而軟件預(yù)測(cè)通常效率不可控，因此通常需要產(chǎn)生較多的候選肽段來(lái)進(jìn)行后續(xù)的化合物優(yōu)化和re-nement步驟，從而增加了方法開(kāi)發(fā)的時(shí)間。

而在實(shí)驗(yàn)室擁有高分辨質(zhì)譜的情況下，我們可以大大簡(jiǎn)化這一步驟。我們將目標(biāo)單抗摻入BSA基質(zhì)進(jìn)行酶解，隨后采用Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行DDA的數(shù)據(jù)采集，生成的數(shù)據(jù)使用Proteome

DiscovererTM (PD) 2.3進(jìn)行非標(biāo)記定量（Label Free Quanti_cation, LFQ）分析，可以輕松的找到強(qiáng)度最高的肽段（圖1b）。隨后我們僅需選出不含漏切位點(diǎn)，不含M, C, KP/RP, HxS/T且長(zhǎng)度合適的肽段即可。采用Orbitrap進(jìn)行LFQ分析后，我們不僅可以獲得肽段的強(qiáng)度信息（圖2a, 2b），還

可以獲得每條肽段的注釋二級(jí)譜，幫助我們?cè)谔暨x離子對(duì)時(shí)排除掉一些諸如中性丟失等選擇性差的離子對(duì)（圖2c）。

為了幫助我們?cè)诙繂慰顾幬飼r(shí)更好的監(jiān)控藥物在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)完整性，我們?cè)趩慰购愣▍^(qū)的四個(gè)主要結(jié)構(gòu)域均挑選了2-3條候選肽段來(lái)進(jìn)行后面的優(yōu)化和精選（圖3）。LSP2，HSP2和HSP8三條候選肽段均含有半胱氨酸殘基（圖3b,3c），在IAA處理后會(huì)形成烷基化的固定修飾，理論上不適合作為定量肽段，但為了保證每個(gè)結(jié)構(gòu)域均有肽段能夠參與定量，我們依舊在優(yōu)化和精選步驟將中它們計(jì)入考察。

• 賽默飛TSQAltis?三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀

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