登革熱IgG檢測試劑

Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法是用來定量檢測二次感染登革熱病毒（1~4型）IgG抗體的方法。可以作為診斷二次感染登革熱的臨床實驗室檢測輔助手段，能與登革熱IgM捕獲ELISA法聯(lián)合應用來鑒別初次感染或是二次感染。這個方法僅能用來檢測具有臨床登革熱癥狀的病人的樣本。陽性結果必須經(jīng)病毒分離、雙份血清分析、免疫組織化學檢測抗原或病毒核酸檢測證實有登革熱病毒感染。

登革熱病毒是一種黃病毒屬，廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)。世界上一半人口生活在這些地區(qū)，處在登革熱傳染的危險之下。就其引起人類的發(fā)病率和死亡率來論，登革熱已成為zui重要節(jié)肢動物疾病。有4種不同的、但在抗原學上相關的登革熱病毒類型。它通過雌性蚊子，特別是埃及伊蚊、白紋伊蚊和波利尼西亞伊蚊來傳播。

登革熱病毒感染的臨床表現(xiàn)多種多樣，從亞臨床癥狀到死亡。根據(jù)疾病的嚴重程度可以分級如下：非特異性熱性疾病、典型的登革熱、登革出血熱（DHF）（I級和II級）和登革休克綜合癥（III 級和IV級）。典型的登革熱表現(xiàn)為突然發(fā)熱伴隨著兩種或更多種的癥狀：頭痛、后眼眶痛、肌痛、關節(jié)痛、出疹、出血表現(xiàn)以及白細胞減少癥。雙相熱型、失眠和由于味覺喪失或苦味引起的食欲不振都很常見。DHF和DSS很嚴重，是經(jīng)常伴隨著第二種血清型感染而出現(xiàn)的可能會致死的并發(fā)癥。

在登革熱流行的那些國家，大多數(shù)病人會有二次感染?？贵w的檢測有助于診斷，特別是二次和繼后的感染，那時并發(fā)癥的發(fā)生率很高。一般地，血凝反應-抑制（HAI）滴度用來分類初次感染或是二次感染。目前結果的確定依賴于至少7天內及時分離得來的配對血清樣本的分析，HAI滴度≥ 1:2560的急性樣本確定為來自第二次黃病毒屬感染的病人。然而，根據(jù)HAI分類登革熱病例的普遍適用性由于血凝素在不同實驗室的可變性而受到了質疑。

Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法是一種替代HAI分析登革熱二次感染血清學診斷的有效方法，因為它通過使用標準物校準減少了登革熱血清在實驗室間的變異。不像HAI，不需要用丙酮萃取血清，如果得到了陽性結果，血清也無須出院后獲得。登革熱二次感染表現(xiàn)為感染發(fā)作后1~2天出現(xiàn)可檢測的高IgG水平，這可能伴隨有IgM水平的升高。高IgG水平（>22Panbio單位）因此作為登革熱病毒二次感染的標志。

血清IgG抗體和包埋在微孔板測試帶（測定板）聚苯乙烯表面的抗-人IgG抗體相結合。在每個含有登革熱病毒抗原（1~4型）的抗原瓶中加入抗原重組緩沖液。在重組抗原中加入相同體積的辣根過氧化物酶（HRP）-結合單克隆抗體（MAb）,形成抗原-Mab復合物。沖洗走測定板上的殘存血清，加入復合的抗原-Mab。然后抗原-Mab復合物和血清登革熱-特定IgG抗體結合。孵育后，沖洗微孔板，再加入無色底物，四甲基聯(lián)苯胺/過氧化氫TMB/H2O2。底物被HRP水解，如果有的話，那色原體就會變成藍色。用酸終止反應后，TMB變成黃色。顏色的變化是測試樣本中存在抗-登革熱IgG抗體的標志。

1．抗-人IgG-包埋的微孔板-（綠色的測定板）（12＊8個孔）。備用。沒有用過的微孔應立即重新密封好，貯存在有干燥劑的地方。在2-8oC穩(wěn)定至失效。

2．裝在瓶中的穩(wěn)定的登革熱抗原-1、2、3、4型登革熱病毒抗原凍干在小瓶中。沒有用過的凍干的抗原應該貯存在2-8oC。重組抗原能冷凍保存和解凍一次。凍干抗原在2-8oC穩(wěn)定至失效。

3．洗滌緩沖濃縮液-一瓶60ml裝，吐溫20和防腐劑（0.1% ProclinTM）20倍濃縮的磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.2-7.6。[在低溫下可能會形成結晶。為避免這種情況，把它放在37度直至變得透明。充分混勻。]在1份洗滌緩沖濃縮液加入19份蒸餾水稀釋。稀釋的緩沖液在2~25oC可以貯存一個星期。

4．血清稀釋液-兩瓶50ml裝（粉紅色）。備用。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水pH 7.2-7.6 含防腐劑（0.1% Proclin）和添加劑。在2~8度保持穩(wěn)定直至失效。

5．抗原重組緩沖液-一瓶7ml裝（透明色）。備用。緩沖液含有防腐劑（0.1% Proclin）和蛋白穩(wěn)定劑。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

6．辣根過氧化物酶結合單克隆抗體示蹤劑-一瓶7ml裝（綠色）。備用。辣根過氧化物酶結合單克隆抗體示蹤劑含防腐劑（0.1% Proclin.）和蛋白穩(wěn)定劑。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

7．四甲基聯(lián)苯胺 TMB-一瓶15ml裝。備用。3,3,5,5''-TMB和枸酸鹽緩沖液（pH 3.5-3.8）內的過氧化氫的混合物。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

8．IgG反應對照血清-一個紅色有蓋的瓶子裝有200µL人血清（含有0.1%疊氮化納和0.005%硫酸霉素）。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

9．IgG標準血清-一個黃色有蓋瓶子裝有400µL人血清（內含0.1%疊氮化納和0.005%硫酸霉素）。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

10．IgG陰性對照血清-一個綠色有蓋的瓶子裝有200µL人血清（含有0.1%疊氮化納和0.005%硫酸霉素）。在2~8oC保持穩(wěn)定直至失效。

11．終止液-一個瓶子15ml裝。備用。1M磷酸。在2~25oC保持穩(wěn)定直至失效。

Proclin. 300是RohmHaas公司的注冊商標產(chǎn)品

預警：

在這些成份里疊氮化納的濃度是有毒性的，是屬于下列級別R22, R32的：“吞食有毒"和“和酸接觸會釋放出有毒氣體"

另外必需具備但不提供的材料：

1．精確可調節(jié)微量移液器（5-1000µL容量），配備一次性使用吸管

2．去離子水

3．微量培養(yǎng)板洗滌系統(tǒng)

4．酶標儀配備450nm濾波片

5．計時器

6．刻度量筒

7．燒瓶

8．血清稀釋用的試管或微量滴定板

警示: 用于體外診斷用

i 用在準備對照時的所有人類來源的材料在測試對人類缺陷性病毒1和2（HIV1和2）、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒表面抗原抗體時，都為陰性。但是沒有哪種方法能夠*保證，所以所有的人體對照和抗原都應該認為是潛在的感染源。疾病預防控制中心和國家健康署建議可能傳染的抗原應該在2級生物安全下進行處理。

ii 這種測試只能用血清。用全血、血漿或是其它的樣本間質不能做。

iii 黃疸的或黃體脂蛋白血清，或表現(xiàn)出溶血的，或有細菌生長的血清都不可用。

iv 不要加熱失活的血清。

v 在開始實驗前，所有的試劑必須要平衡至室溫（20~25oC）。試驗受到室溫變化的影響。只有達到了室溫才能把微孔板從密封包里拿出來。

vi 用干凈的槍頭直接在瓶子里配試劑。轉移試劑可能會導致污染。

vii 未用過的微孔板，應立即重新封存，并儲存有干燥劑的地方。如果不這樣做可能會造成錯誤的結果。

viii 底物系統(tǒng)

a 由于TMB易受金屬離子污染影響,所以不允許底物系統(tǒng)和金屬表面接觸。

b 避免長時間暴露于陽光直射下。

c 一些洗滌劑可能會干擾TMB的表現(xiàn)。

d TMB可能會有一些淡藍色。這個不會影響底物的活性或者試驗的結果.

警告

為獲得更多的安全信息請參照從PANBI0得到的原料安全數(shù)據(jù)表（MSDS）.

標本收集和準備

讓靜脈血在室溫下（20~25oC）凝結成塊，然后根據(jù)全國臨床實驗標準委員會NCCLS（收集診斷靜脈血的認可標準程序，H3-A4, 1998）進行離心。

血清應盡快分離并冷藏（2~8oC），如果在兩天內不試驗的話，就應該冷凍（-20oC或更低的溫度）。不推薦使用自我解凍的致冷機。黃疸血清、有溶血的、脂血的或是有細菌生長的血清都不推薦使用。CLSI提供貯存血樣的建議。（血樣處理加工的認可標準程序，H18-A2, 1999）。

測試程序：

注意：確保在實驗前，所有的試劑都平衡至室溫（20~25oC）。在超出所提供的時間和溫度范圍內試驗可能會導致無效的結果。沒有在即定的時間和溫度內進行的試驗應重復一次。

血清預稀釋：

i 從箔袋內拿出所需數(shù)量的微孔板，并插入夾板固定器。5個板分別是陰性對照、陽性對照和三個標準物。確保剩下未用的微孔板緊緊地密封在箔袋內。

ii 用合適的試管或微量滴定板稀釋陽性對照，陰性對照，標準物和病人樣品。

a 在10µL血清中加入1000µL血清稀釋液。充分混勻。或者

b 在10µL血清中加入90µL血清稀釋液。取出20µL稀釋的血清加入180µL血清稀釋液。充分混勻。

EELISA操作步驟：

對方法的概括參見附圖

a    穩(wěn)定的抗原瓶。

i                 從試劑盒內取出所需的凍干抗原瓶。每瓶可足夠2條帶16個孔使用。在每瓶內各加入1ml的抗原重組緩沖液?；靹虼_?？乖芙?。如果完好的重組抗原沒有用過，將它保存在-80oC直至所需。確保剩下沒用的重組抗原貯存在2~8oC。

ii               取出所需量的重組抗原，然后在一個干凈的玻璃或塑料瓶里混合相同體積的MAb 示蹤劑。輕輕地混勻抗原和MAb示蹤劑溶液，再在室溫下保持至所需時。為測試板總量微孔準備足夠的抗原瓶，也即每瓶抗原可夠16個孔（2條帶）使用。

b    測試板

i                 混勻后10分鐘內，吸取100µL稀釋的病人樣本和對照，分別加入測試板相應的微孔內。

ii               蓋上測試板，在37°C±1°C孵育1小時。

iii             用稀釋的洗滌緩沖液沖洗6次。（參見下面的沖洗步驟）。

iv              混勻抗原和MAb示蹤劑。吸取100 µL混勻物，加入測試板相應的孔內。

v                蓋上測試板，在37°C±1°C孵育1小時。

vi              用稀釋的洗滌緩沖液沖洗6次。（參見下面的沖洗步驟）。

vii            在每個孔內加入100 µL TMB。

viii          從*次加入算起，在室溫下20-25°C 孵育10分鐘。將會出現(xiàn)藍色。

ix              按TMB加入的時間和順序，在所有的孔內加入100 µL終止液?；靹?。藍色將會變成黃色。

x                30分鐘內讀數(shù)，波長450nm，參照濾波器600~650nm。

注意：如果是雙波長分光光度計，在600~650nm間設定參照濾波。如果在450nm讀數(shù)沒有參照濾波時，可能會由于背景因素出現(xiàn)更高的吸光值。

有效的沖洗能去除沒有混合的樣品或成分，這對于ELISA程序是很有必要。

A．全自動沖洗板

1 吸光所有孔內容物。

2 在沖洗過程中，洗滌緩沖液要注滿孔（350 µL）

3 6次沖洗完后，把板翻轉，在吸水紙上用力敲打確保去除所有的沖洗緩沖液。

4 全自動沖洗板一定要維護好，確保沖洗效果。在所有時間內都要遵照制造商的沖洗說明。

B. 人工沖洗

1 把內容物倒入合適的廢物缸。

2 用一個合適的擠壓瓶把洗滌緩沖液加滿孔，避免起泡，因為這可能會降低沖洗效果。立即倒掉緩沖液。

3 重新加滿，再立即倒掉。

4 再重復4次步驟3?？偣灿孟礈炀彌_液洗6次。

5 洗完zui后一次后，倒掉孔內容物，把板翻轉，在吸水紙上用力敲打確保去除所有的沖洗緩沖液。

每個試劑盒包括標準物，陽性對照和陰性對照血清。在隨附的說明表列有這些血清合適值。那陰性和陽性對照是用來監(jiān)測由試劑引起的失敗。陽性對照不能確保試驗臨界點的精確度。如果對照或標準的吸光度值沒有達到說明書標準，則測試無效，就應該重做。如果測試無效，病人結果就不能報告。質量控制需要必須遵照當?shù)氐?、州?或國家法律或委任書和你們實驗室標準質量程序。

建議用戶參照NCLSI C24-A和42 CFR 493.1202c中的合適的質量控制實踐指導。

1 計算三個標準物的平均吸光度值。這是臨界值。

2 樣品的吸光度除以臨界值就得到指數(shù)值。

或者

3 指數(shù)值乘以10就得到Panbio 單位。

指數(shù)值=樣品的吸光度/臨界值

例如：樣品A的吸光度=0.949

樣品B的吸光度=0.070

臨界值=0.302

樣品A 0.949/0.302=3.14指數(shù)值

樣品B 0.070/0.302=0.23指數(shù)值

Panbio 單位=指數(shù)值 X 10

樣品A 3.14 X 10 = 31.4 Panbio 單位

樣品B 0.23 X 10 = 2.3 Panbio 單位

結果解釋：

登革熱IgG捕獲ELISA法檢定二次登革熱病毒感染病人血清中IgG抗體水平。陽性結果（> 22 Panbio 單位）表明急性二次登革熱感染。如果要區(qū)分是初次還是二次感染，就應該用到登革熱Duo ELISA法。

解釋

結果解釋

推薦一種報道結果的方法：由Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法得出下列結果。不同方法得出的結果不能互換。測量結果超出臨界值不表示現(xiàn)有抗體總量。結果應該報告為陽性、陰性或可疑，而不能報數(shù)值。

1．臨床診斷必須根據(jù)臨床癥狀和病人體征來解釋。從試劑得來的結果不是診斷性的。應該結合臨床數(shù)據(jù)和病人癥狀來考慮。

2．在不同的地理區(qū)域，人群血清流行病學可能會隨著時間的改變而變化。因此，那臨界值可能需要根據(jù)當?shù)氐难芯窟M行調整。

3．不能用來做一般人群的篩查。陽性預值依賴于現(xiàn)存在病毒的可能性。只能對有臨床癥狀的病人進行測試，或者有可疑暴露時。

4．和黃病毒屬出現(xiàn)血清學交叉反應是常見的事（即在登革熱1，2，3，4型和日本腦炎、墨累山谷腦炎、圣路易腦炎、黃熱病、西尼羅河病毒等之間）。在確診前必須排除這些疾病。在做登革熱IgG捕獲ELISA法的臨床試驗中，我們觀察到IgG水平之間也存在交叉反應，在其它組也有類似的發(fā)現(xiàn)。

5．免疫測定中的嗜異染抗體是一種很好識別的干擾原因。這些動物IgG抗體可能會與試劑IgG抗體交叉反應并產(chǎn)生假陽性。這在確診前也必須被排除。

6．沒有為可視的結果確定建立表現(xiàn)特征。

7．這個測定利用昆蟲表達蛋白。人類抗-昆蟲抗體的交叉反應或干擾對測定結果來說是不可知的。

8．根據(jù)Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法，所有的血清都顯示為一個陽性結果時，這時應該送交參照實驗室進行確定和流行病學記錄。

登革熱二次感染表現(xiàn)為在感染發(fā)作后的1~2天特異性IgG水平很高，而且大多數(shù)病例還伴有IgM水平的升高。

在一些二次感染中，可檢測到的IgG抗體水平可能是低的。一些病人在感染后的頭7~10天可能不會產(chǎn)生可檢測到水平的抗體。只要癥狀還存在，我們就建議在*份樣本后的4~7天對病人重新進行測試。

在馬來群島的一所大學里，我們用Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法對血凝抑制和內部ELISA法標記的146份回顧性血清進行了測試。這些血清包括30份地方性的血清陰性樣本，60份表現(xiàn)為初次登革熱感染陽性的血清樣本和56份表現(xiàn)為二次登革熱感染陽性的樣本。結果用來測定該方法的靈敏性，特異性和一致性。數(shù)據(jù)見表1。

表1 Panbio ELISA血清學靈敏性和特異性與登革熱疾病狀況的比較

Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法

＊可疑樣本的重測試沒有計算在內。

95% CI＊

血清學靈敏性（二次感染）b =48/56  = 85.7%    73.8 – 93.6%

血清學特異性（初次感染）b = 56/60  = 93.3%   83.8 – 98.2%

血清學特異性（血清陰性）  = 30/30  = 100.0%  88.4 – 100.0%

血清學一致性b             =134/146  = 91.8%  86.1 – 95.7%

a 樣品經(jīng)HAI法（滴度≥2560）檢測為二次登革熱感染陽性。

b可疑數(shù)不包括可疑樣本的重測試。（見上＊）

＊CI=可疑區(qū)間

為了測定Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法試劑盒的重現(xiàn)性，我們用3個批號的試劑盒在不同的3天對8份血清每份進行了3次測試。用方差分析對組內、日間、組間和總的精密度進行了分析。結果見表2。

表2 Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法精密度測定（用指數(shù)值＊）

所有的值都是從指數(shù)值計算得來的

SD=標準差； CV=變異系數(shù)

注意：由于列表原因，標準差結果保留兩位小數(shù)

＊樣品吸光度除以臨界值得到指數(shù)值。

通過測試一組66份來自其它確診病人（非登革熱）的樣品來測定Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法的診斷特異性。那樣品來自于患有可能存在交叉反應疾病的病人。測試中的每份樣品的Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法分析都要服從于其疾病診斷。結果參見表3。

表3 Panbio登革熱IgG捕獲ELISA法-交叉反應分析