詳細(xì)介紹
英文名稱:Diagnostic Kit for Human Enterovirus 71(HEV71)and Coxsackievirus A 16 virus(CoxA16)Viral Nucleic Acid(Fluorescence PCR)
產(chǎn)品特點(diǎn):
本試劑用于對咽試子、肛試子樣本中腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型RNA進(jìn)行定性檢測,用于腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型感染的輔助診斷及流行病學(xué)監(jiān)控。
【檢驗(yàn)原理】根據(jù)熒光PCR技術(shù)原理,針對腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型基因設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman探針,通過熒光PCR檢測儀進(jìn)行檢測,從而實(shí)現(xiàn)對腸道病毒病毒RNA的定性檢測。
該系列的熒光PCR法檢測試劑盒內(nèi)包含滿足48人份檢測所需要的試劑,同常規(guī)RT-PCR檢測方法相比,該檢測試劑盒具有以下的優(yōu)點(diǎn):
1、無需電泳分析PCR終末產(chǎn)物;
2、在PCR擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)檢測核酸的擴(kuò)增;
3、具有快速、簡便、敏感和特異的優(yōu)點(diǎn);
4、可以防止因打開PCR產(chǎn)物污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。
試驗(yàn)方法:
取200μl咽試子(肛試子)樣本進(jìn)行核酸提取。采用北京金豪制藥股份有限公司的核酸分離試劑盒 (硅膠膜吸附法),該試劑盒可用于對腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型樣本中的病毒RNA提取,并按試劑盒說明書要求操作。
本品中的陰性、陽性對照參與核酸提取。
2. PCR擴(kuò)增:
2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):
2.1.1待檢樣本檢測:每份樣本使用腸道病毒反應(yīng)液進(jìn)行檢測,根據(jù)腸道病毒反應(yīng)液的檢測結(jié)果對樣本進(jìn)行判定。
2.1.2對照品檢測:每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)置陰性對照和陽性對照。
2.2反應(yīng)體系的配制:
2.2.1準(zhǔn)備工作:將腸道病毒反應(yīng)液融化后振蕩混勻,離心6000rpm 10秒。
2.2.2 反應(yīng)體系配制:取1個(gè)1.5ml 無核酸酶離心管,計(jì)算待測樣本數(shù)量(n),取20μl×(n+2)腸道病毒反應(yīng)液、1μl×(n+2)DNA聚合酶和0.35μl×(n+2)逆轉(zhuǎn)錄酶充分混勻,離心6000rpm 10秒。
n+2=n份樣本+1份陽性對照+1份陰性對照;
2.3反應(yīng)體系分管:
每份待測樣本設(shè)置1個(gè)PCR擴(kuò)增管,分別將每種反應(yīng)體系按20μl/管分裝至對應(yīng)的PCR擴(kuò)增管中。
2.4加樣:
取5μl(待測樣本RNA、陰性對照、陽性對照)分別加入1個(gè)PCR擴(kuò)增管。
2.5擴(kuò)增檢測:
將加樣后的PCR擴(kuò)增管分別轉(zhuǎn)移到全自動熒光定量PCR檢測儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測,不同儀器的設(shè)置詳見說明書...
結(jié)果的解釋、產(chǎn)品性能指標(biāo):
4.1陰性對照無Ct值或Ct值為0。
4.2 陽性對照Ct值小于30.0。
【參考值(參考范圍)】
Ct值≤37.0報(bào)告該反應(yīng)陽性;無Ct值或Ct值為0報(bào)告該反應(yīng)陰性;
37.0<Ct值<40.0為灰區(qū)。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
結(jié)果在灰區(qū)的樣本需重復(fù)試驗(yàn):取400μl樣本重新提取RNA(核酸分離試劑盒中裂解液、助沉劑、無水乙醇的用量加倍,其他組分的用量不變)并檢測。復(fù)檢結(jié)果Ct<40.0的樣本為陽性,否則為陰性。
【檢驗(yàn)方法的局限性】
本試劑盒檢測的靶序列分別為腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型基因,該靶基因在各毒株間都是高度保守且很穩(wěn)定。但如果在靶序列處發(fā)生基因突變,則有可能造成假陰性結(jié)果,即發(fā)生漏檢。
規(guī)格、有效期:
【儲存條件及有效期】-20℃冷凍保存,有效期暫定6個(gè)月,陽性對照反復(fù)凍融次數(shù)不得超過5次。
【適用儀器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光PCR檢測儀。
【樣本要求】1. 樣本類型:咽試子、肛試子。