詳細(xì)介紹
英文名稱:Diagnostic Kit for Human Enterovirus 71(HEV71)and Coxsackievirus A 16 virus(CoxA16)Viral Nucleic Acid(Fluorescence PCR)
產(chǎn)品特點(diǎn):
本試劑用于對(duì)咽試子、肛試子樣本中腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型RNA進(jìn)行定性檢測(cè),用于腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型感染的輔助診斷及流行病學(xué)監(jiān)控。
【檢驗(yàn)原理】根據(jù)熒光PCR技術(shù)原理,針對(duì)腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型基因設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman探針,通過(guò)熒光PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道病毒病毒RNA的定性檢測(cè)。
該系列的熒光PCR法檢測(cè)試劑盒內(nèi)包含滿足48人份檢測(cè)所需要的試劑,同常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法相比,該檢測(cè)試劑盒具有以下的優(yōu)點(diǎn):
1、無(wú)需電泳分析PCR終末產(chǎn)物;
2、在PCR擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸的擴(kuò)增;
3、具有快速、簡(jiǎn)便、敏感和特異的優(yōu)點(diǎn);
4、可以防止因打開(kāi)PCR產(chǎn)物污染樣品的風(fēng)險(xiǎn)。
試驗(yàn)方法:
取200μl咽試子(肛試子)樣本進(jìn)行核酸提取。采用北京金豪制藥股份有限公司的核酸分離試劑盒 (硅膠膜吸附法),該試劑盒可用于對(duì)腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型樣本中的病毒RNA提取,并按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。
本品中的陰性、陽(yáng)性對(duì)照參與核酸提取。
2. PCR擴(kuò)增:
2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):
2.1.1待檢樣本檢測(cè):每份樣本使用腸道病毒反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)腸道病毒反應(yīng)液的檢測(cè)結(jié)果對(duì)樣本進(jìn)行判定。
2.1.2對(duì)照品檢測(cè):每次試驗(yàn)都應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
2.2反應(yīng)體系的配制:
2.2.1準(zhǔn)備工作:將腸道病毒反應(yīng)液融化后振蕩混勻,離心6000rpm 10秒。
2.2.2 反應(yīng)體系配制:取1個(gè)1.5ml 無(wú)核酸酶離心管,計(jì)算待測(cè)樣本數(shù)量(n),取20μl×(n+2)腸道病毒反應(yīng)液、1μl×(n+2)DNA聚合酶和0.35μl×(n+2)逆轉(zhuǎn)錄酶充分混勻,離心6000rpm 10秒。
n+2=n份樣本+1份陽(yáng)性對(duì)照+1份陰性對(duì)照;
2.3反應(yīng)體系分管:
每份待測(cè)樣本設(shè)置1個(gè)PCR擴(kuò)增管,分別將每種反應(yīng)體系按20μl/管分裝至對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增管中。
2.4加樣:
取5μl(待測(cè)樣本RNA、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照)分別加入1個(gè)PCR擴(kuò)增管。
2.5擴(kuò)增檢測(cè):
將加樣后的PCR擴(kuò)增管分別轉(zhuǎn)移到全自動(dòng)熒光定量PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),不同儀器的設(shè)置詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)...
結(jié)果的解釋、產(chǎn)品性能指標(biāo):
4.1陰性對(duì)照無(wú)Ct值或Ct值為0。
4.2 陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于30.0。
【參考值(參考范圍)】
Ct值≤37.0報(bào)告該反應(yīng)陽(yáng)性;無(wú)Ct值或Ct值為0報(bào)告該反應(yīng)陰性;
37.0<Ct值<40.0為灰區(qū)。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
結(jié)果在灰區(qū)的樣本需重復(fù)試驗(yàn):取400μl樣本重新提取RNA(核酸分離試劑盒中裂解液、助沉劑、無(wú)水乙醇的用量加倍,其他組分的用量不變)并檢測(cè)。復(fù)檢結(jié)果Ct<40.0的樣本為陽(yáng)性,否則為陰性。
【檢驗(yàn)方法的局限性】
本試劑盒檢測(cè)的靶序列分別為腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型基因,該靶基因在各毒株間都是高度保守且很穩(wěn)定。但如果在靶序列處發(fā)生基因突變,則有可能造成假陰性結(jié)果,即發(fā)生漏檢。
規(guī)格、有效期:
【儲(chǔ)存條件及有效期】-20℃冷凍保存,有效期暫定6個(gè)月,陽(yáng)性對(duì)照反復(fù)凍融次數(shù)不得超過(guò)5次。
【適用儀器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動(dòng)熒光PCR檢測(cè)儀。
【樣本要求】1. 樣本類(lèi)型:咽試子、肛試子。