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29 2012年 12月: 對(duì)scFv基因文庫(kù)及pHEN1噬菌體展示栽體的限制性消化

[方法]1，配制兩個(gè)100ulPCR反應(yīng)混合液來(lái)消化scFV文庫(kù)，其中1個(gè)用于VH-VκscFv文庫(kù)，另1個(gè)用于VH-VλscFv文庫(kù)，該混合液含有：●scFVDNA（1～4ug），50ul●水，33ul●10×NEB3緩沖液，10ul●乙酰BSA（100×），1．0ul●Nco工（10U/ul），3．0f11●NoJ工（10U/ul），3．0ul2．37℃孵育反應(yīng)液過夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置，防止水分蒸發(fā)?；蛘撸梢园碢CR反應(yīng)那樣加一層礦物油（Sigma）。3．用1%瓊脂糖
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27 2012年 12月: 電轉(zhuǎn)化連接物構(gòu)建抗體文庫(kù)

[方法]1．將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。2．在冰上復(fù)溶電感受態(tài)細(xì)菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細(xì)胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細(xì)胞和DNA均放于冰上。3．將80ng已純化且無(wú)鹽的DNA與50g1細(xì)菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。4．將混合物轉(zhuǎn)移至0．2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。5．將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，確保小杯側(cè)面干燥（以免電弧）。啟動(dòng)脈沖，立即加入1．0mlSOC培養(yǎng)基并混合。
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27 2012年 12月: 制備用于抗原上選擇的噬菌體抗體

抗體文庫(kù)儲(chǔ)存料中制備噬菌體。在開始實(shí)驗(yàn)之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板）計(jì)算每毫升抗體文庫(kù)儲(chǔ)存料中細(xì)菌的數(shù)目。在600nm（A600）處的某個(gè)特定吸光值下，抗體文庫(kù)中細(xì)菌數(shù)目較未感染細(xì)菌數(shù)目低一些。這或許是因?yàn)楹匈|(zhì)粒的文庫(kù)細(xì)菌體積更大，或者是存在死細(xì)菌。一旦滴度與A600確定關(guān)系，吸光值即可用于細(xì)菌數(shù)目的計(jì)算。對(duì)于噬菌體的制備（文庫(kù)救援），來(lái)自文庫(kù)儲(chǔ)存料的起始接種量應(yīng)比文庫(kù)容量大5倍。接種到培養(yǎng)基后，細(xì)菌濃度的A600不應(yīng)超過0．05。采用文庫(kù)容量5倍以上的細(xì)菌接種
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25 2012年 12月: 用氯化銫離心法純化噬菌體

1．在每毫升zui后的噬菌體懸液（例如來(lái)自實(shí)驗(yàn)方案13．11）中，加入0．45g氯化銫，充分混勻至溶解。2．用吊桶式轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)男吞?hào)）離心溶液，15℃17h，噬菌體將濃縮在組分1和組分2中（。組分1的濃度較高，但組分2的體積較大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取這些組分。如果是*次使用本實(shí)驗(yàn)方案，那么先收集所有條帶并分別對(duì)其檢測(cè)將是明智之舉。3．將收獲的溶液對(duì)PBS透析過夜。4．通過感染大腸桿菌DH5cF，或TGl滴定各個(gè)不同組分中噬菌體，并保存滴度zui高的組分。通常，噬菌體會(huì)集中在1個(gè)區(qū)帶內(nèi)
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25 2012年 12月: 從噬菌體文庫(kù)選擇抗原特異性抗體

從噬菌體抗體文庫(kù)中分離抗原特異性抗體，是通過讓噬菌體進(jìn)入到在抗原上進(jìn)行的重復(fù)性選擇循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。理想情況下，僅需l輪選擇即可完成。但事實(shí)是，絲狀噬菌體常常非特異性地結(jié)合到支持物表面，從而限制了每輪所能獲得的富集水平。實(shí)際上，需要2～5輪的選擇?，F(xiàn)在已設(shè)計(jì)了許多各自不同的選擇方法；其中包括在固相支持物上包被抗原進(jìn)行生物淘選，使用免疫親和層析注或BIAcore傳感芯片，用生物素化抗原選擇E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳動(dòng)物E403細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞E41-433、新鮮細(xì)胞上進(jìn)行
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22 2012年 12月: 在微量滴定板中進(jìn)行可溶性SCFv ElISA的方法

1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過夜。PBS中10ug／m1的濃度是包被抗原的標(biāo)準(zhǔn)濃度。但有時(shí)需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液（比如碳酸鹽緩沖液）。2．棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封閉每個(gè)板孔，37℃孵育2小時(shí)。4．用PBS洗滌板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗體的培養(yǎng)基上清，用移液器反復(fù)吹吸混勻，室溫孵育1小時(shí)。7．棄去溶液，用PBS／Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次。8．每孔加入100
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22 2012年 12月: 噬菌體抗體的親和力成熟

噬菌體展示可使抗體親和力提高到1000倍以上。很典型的起始點(diǎn)是自噬菌體抗體文庫(kù)中分離特異性抗體。為完成親和力的成熟（親和力的增加），要對(duì)抗體序列進(jìn)行多樣化；突變基因文庫(kù)展示在絲狀噬菌體表面上，并在抗原上選擇具有更高親和力的結(jié)合性抗體。盡管整個(gè)過程已相當(dāng)清晰，但研究者在進(jìn)行體外親和力成熟前必須明確：提高特定抗體親和力將會(huì)產(chǎn)生預(yù)期的生物學(xué)效果。當(dāng)嘗試用抗體中和循環(huán)中的毒素或生長(zhǎng)因子時(shí)，更高的親和力就顯得特別重要。在此情況下，抗體與抗原都分布于同樣的區(qū)域，能使抗原抗體的相互作用達(dá)到平衡狀態(tài)。親和力越高
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20 2012年 12月: 利用血清篩選噬菌體文庫(kù)

利用含有目標(biāo)受體的復(fù)雜混合物，對(duì)噬菌體展示肽文庫(kù)進(jìn)行篩選。這適用于許多令人感興趣的生物體系，如血清、腦脊液及其他生物性體液和細(xì)胞或組織表面等。在此情況下，目標(biāo)就是要鑒定出結(jié)合于特定受體分子或結(jié)合于一組具有特定性質(zhì)的受體上的多肽。我們及他人都在致力于鑒定那些可與疾病特異性相關(guān)的抗體（疾病特異性抗體，DS-Ab）相結(jié)合的多肽。這里我們所描述的方法，是用來(lái)鑒定丙型肝炎感染（HCV）特異性相關(guān)抗體的相應(yīng)配體。HCV是一種性慢性肝病的主要病因。利用來(lái)自HCV感染者和非感染者的血清（以下分別稱為陽(yáng)性血清和陰
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