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19 2013年 02月: Colony hybridization重組質(zhì)體的檢定

方法步驟：1）前一天轉(zhuǎn)形的培養(yǎng)皿，當(dāng)菌落長(zhǎng)至約0.5mm大小時(shí)，將培養(yǎng)皿移至4℃放置1h。2）準(zhǔn)備一張無(wú)菌的硝化纖維濾膜，以鉛筆在邊緣標(biāo)上組別?！粽?qǐng)戴手套后再拿取濾膜！3）打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子，以?xún)芍П馄借囎訉V膜兩邊夾住，輕輕覆蓋在菌落上方，盡可能避免有氣泡產(chǎn)生?！糇⒁猓V膜覆蓋上去后就不要再移動(dòng)！4）等濾膜*濕透后，以針頭在濾膜邊緣戳洞做記號(hào)（至少做三個(gè)記號(hào)）。小心把濾膜掀起，菌落朝上放置在LB/Amp/IPTGplate上。蓋上蓋子，在37℃培養(yǎng)2~4h，以誘導(dǎo)啟動(dòng)T5promoter，表現(xiàn)其下
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19 2013年 02月: Histochemical detection重組質(zhì)體的檢定

儀器用具：平端鑷子藥品試劑：Nitrocellulose濾膜LB/Amp/IPTG/X-Glucplate（LBplate添加100μg/mLampicillin,0.2MIPTG,50μg/mLX-Gluc）方法步驟：1）前一天進(jìn)行轉(zhuǎn)形的培養(yǎng)皿，當(dāng)菌落長(zhǎng)至約0.5mm大小時(shí)，將培養(yǎng)皿移至4℃放置至少1h。2）準(zhǔn)備一張無(wú)菌的硝化纖維濾膜，以鉛筆在邊緣標(biāo)上組別?！粽?qǐng)戴手套后再拿取濾膜！3）打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子，以?xún)芍П馄借囎訉V膜兩邊夾住，輕輕覆蓋在菌落上方，盡可能避免有氣泡產(chǎn)生?！糇⒁?！濾膜覆蓋上去后
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16 2013年 01月: 酶活性分析法檢定蛋白質(zhì)

方法步驟：1）吸取20μL的蛋白質(zhì)樣本，小心注入微量滴定盤(pán)中，避免氣泡產(chǎn)生。2）每一樣品槽加入200μL基質(zhì)液，混合均勻；可用燒熱的接種環(huán)去除氣泡。3）靜置約1~2min，顏色開(kāi)始加深，然后加入30μL終止液。反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短，要以樣本中的酶活性大小來(lái)做調(diào)整。因?yàn)槲覀冎粶y(cè)定色析法各分劃的相對(duì)酶活性，因此并不加終止液。4）以ELISA光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)415nm的吸光值。酶活性單位的測(cè)定：a.以上步驟，只可測(cè)定GUS活性的相對(duì)大小，對(duì)色析法所得到的各個(gè)分劃進(jìn)行偵測(cè)，相當(dāng)方便，但并非酶活性單位的測(cè)定方法。
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16 2013年 01月: 免疫染色法檢定蛋白質(zhì)

方法步驟：1）尿素洗過(guò)夜的轉(zhuǎn)印紙?jiān)僖?0mLPBST洗三次，每次約10min，均在上述方形培養(yǎng)皿中進(jìn)行。2）轉(zhuǎn)印紙放在明膠NET溶液中反應(yīng)，置室溫中反應(yīng)1h。一般使用方形培養(yǎng)皿當(dāng)容器，但亦可裝入塑料袋中反應(yīng)，較節(jié)省試劑用量。3）反應(yīng)后，以PBST浸洗二次。4）把轉(zhuǎn)印紙放在抗體溶液中反應(yīng)，置室溫反應(yīng)1h。5）反應(yīng)后以PBST洗三次，改用酶聯(lián)體反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)1h。6）以PBST洗四至五次，注意容器也要洗干凈。7）加入DAB基質(zhì)溶液約10mL呈色，盡量避光，并且不時(shí)搖動(dòng)呈色液。8）數(shù)分鐘內(nèi)可呈色，
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14 2013年 01月: 再擴(kuò)增SCFvVLCDR3基因文庫(kù)添加3’限制性位點(diǎn)

[方法]1．配制4個(gè)50ulPCR反應(yīng)混合液，包含：●去離子水，35．5ul●20×dNTP（每種5mmol/L），2．5ul●10×Vent聚合酶緩沖液，5．0ul●LMB3引物（10pmol/ul），2．5ul●VL—NotI引物（10pmol/ul），2．5ul●scFV基因模板DNA（100ng），1ul●VentDNA聚合酶（2單位），1．0ul2．在有加熱蓋的熱循環(huán)儀內(nèi)，加熱反應(yīng)混合液到94℃5分鐘。3．以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環(huán)30次，擴(kuò)增VL基因。4．
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14 2013年 01月: 連接scFv和載體DNA并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建scFv突變文庫(kù)

[方法]1．配制1個(gè)50ul連接混合液，包含：●10×連接緩沖液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的scFv文庫(kù)（100g/ul）,7ul●T4DNA連接酶（400U／ul），2ul2．16℃孵育反應(yīng)液過(guò)夜。3．乙醇沉淀DNA并用70％乙醇洗滌沉淀1次。4．重懸DNA于10ul水中。5．用4份相同的2．5ul的DNA分別電轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)大腸桿菌TGl細(xì)胞中。6．確定文庫(kù)容量，并將菌文庫(kù)材抖儲(chǔ)存于-70℃。www.shjs
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10 2013年 01月: 篩選解離速率優(yōu)化的scFv

[方法]1．每個(gè)克隆用lml2XTY／amp／S1u30~C培養(yǎng)過(guò)夜，250r／min振蕩。2．取50u1過(guò)夜培養(yǎng)物，加入到含有5ml2XTY／amp／0．1％glu的50ml試管內(nèi)；并在30℃培養(yǎng)大約2小時(shí)，250r／Illin振蕩，吸光度（A600）大約0．9。3．每管加入2．5ullmol／LIPTG誘導(dǎo)scFv表達(dá)（終濃度為500umol／L），并在30℃培養(yǎng)4h，250r／min振蕩。在1個(gè)15mlFalcon試管內(nèi)4000g離心15分鐘，收集細(xì)胞。4．準(zhǔn)備外周質(zhì)提取物。用200u1P
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10 2013年 01月: IHC增敏方法的研究進(jìn)展及技術(shù)改進(jìn)

免疫組織化學(xué)（1HC）或稱(chēng)免疫細(xì)胞化學(xué)是一種方法學(xué)，根據(jù)特異性抗原—抗體反應(yīng)的原理，檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原或抗體成分。IHC有一個(gè)很長(zhǎng)的發(fā)展歷史，已有半個(gè)世紀(jì)以上，自Coons創(chuàng)建免疫熒光組化技術(shù)以來(lái)，不斷有人（或公司）推出更為敏感的方法，經(jīng)過(guò)60多年的不斷努力和發(fā)展，由zui初的免疫熒光直接標(biāo)記法，逐步出現(xiàn)了間接法、免疫酶法、親和細(xì)胞化學(xué)方法、免疫膠體金法，多聚物酶法（或稱(chēng)非生物素放大法）、CSA法、原位免疫PCR法及循環(huán)放大法等。目前提高免疫組化敏感性可通過(guò)如下幾種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。（1）首先是增
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