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08

2013年
01月

膠體金免疫金銀組織化學技術

①膠體金溶液可以重復制備，其顆粒大小可以控制，可較容易進行免疫電鏡的雙重或多重標記；②金標探針有很高的電子密度，有特殊的分辨率，定位準確；③金標探針能發(fā)射二次電子和反射電子，是掃描電鏡目前的標記物；④金標探針與組織細胞內的抗原結合后，可用銀增強，大大提高了IHC的敏感性，是目前zui為敏感的IHC方法之一；⑤免疫金銀染色方法無致癌性，使用較安全。膠體金技術是以膠體金作為一種標記物。膠體金是指金的水溶膠，它具有一般溶膠的特性。溶膠是指一種物質以或大或小的微小粒子分散在另一種物質中所形成的體系。被分
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08

2013年
01月

膠體金的一般性狀

（一）膠體金的顏色溶膠的顏色取決于分散相物質的顏色、分散相物質的分散度和入射光線的種類，是散射光線還是透射光，粒子越小，分散度越高，則散射光的波長越短。對同一種物質的水溶膠來說，粒子大小不同，呈現(xiàn)的顏色亦不同。如膠體金顆粒在5～20nm之間，吸收波長520nm，呈紅色的葡萄酒色；20～40nm之間的金溶膠主要吸收波長530nm的綠色光，溶液呈深紅色；60nm的膠體金溶膠主要吸收波長600nm的橙黃色光，溶液呈藍紫色。一般應用于免疫組織化學的膠體金顆粒為5～60nm范圍內，溶液呈現(xiàn)紅色。在相當?shù)囊?/div> 【查看全文】
06

2013年
01月

大規(guī)模連接及純化連接后的DNA

[方法]1．建立以下連接反應：●載體DNA（pG6AppG6B，pG6C）（10ug）xul●cDNA片段（3～5ug）yul●10×連接緩沖液40ul●T4DNA連接酶（6WeissU/ul）5ul●水400ul2．在16℃過夜孵育。3．在70℃孵育30分鐘，使T4DNA連接酶變性。4．加1體積的乙醇并振蕩45秒，在14000g微離心機中離心10分鐘，然后將上清液轉移到另一新的微離心管中。5．加1體積的24/1（體積比）氯仿/異戊醇并振蕩45秒，在14000g微離心機中離心5分鐘，然后將上清液
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06

2013年
01月

Topl0F’細胞中的電轉化及文庫儲存

[方法]1．加2～3ul純化的連接反應物（zui大值為0.3ugDNA）到80ul的*0F’電轉化感受態(tài)細胞中，輕輕搖晃混合。使用30ng（2ul）的pUCl9控制電轉化效率。2．將細胞+DNA懸浮液轉移到已冷卻的0．2cm細胞電轉化管，并冰浴3分鐘。3，將GenePulserPlus電穿孔儀設置為2．5kV脈沖，電容器設為25uF，脈沖控制器設為200ns。4．用紙巾干燥電轉化管，然后將它放在電轉化箱中，使用一個脈沖（寄存時間常量必須為4．5～5．0毫秒）。5．立即加lmlLB到電擊管中，打散
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04

2013年
01月

gⅥ-cDNA噬菌粒文庫小規(guī)模的獲取和純化

[方法]1．將克隆體接種到100ulLBAT96孔培養(yǎng)板上，并在37℃過夜振蕩培養(yǎng)（180r/min）。2．使用96孔復制板將其接種到裝有200ulLBAT的第二塊96孔培養(yǎng)板上，在37℃培養(yǎng)直到生長中期（大約1，5小時）。3．在每一孔中加入10ul2×1011TU/mlR408輔助噬菌體。4．37℃無振蕩培養(yǎng)30分鐘。5．37℃過夜振蕩培養(yǎng)。6．4℃800g離心20分鐘，收集細胞。7．將上清液轉移到一新的96孔培養(yǎng)板上，并加40pulPEG/NaCl。8．將板放置于冰上1小時。9．4℃800g
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04

2013年
01月

gⅥ-cDNA融合噬菌體ELISA

[方法]1．用200ulPBST沖洗鏈霉素包被的微量濃度測定板的每個孔3次。2．在2mol/LPBS中稀釋生物素配體（BAS噬菌體—ELISA）或生物素捕獲抗體（ISA噬菌體—ELISA），直到終濃度為10—50nmol/l，再加100ul這種溶液到農(nóng)度測定板中的每個孔中。3．在室溫下孵育濃度測定板1小時。4。用200ulPBST沖洗每個孔5次。5．在2mol/LPBS中稀釋噬菌體溶液到濃度為1×1011TU/ml，在*次用來稀釋IAS融合噬菌體的2mol/LPBS中加入誘餌血清或預免疫血清，再
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29

2012年
12月

用scFv接頭PCR裝配VH和VL進行scFv基因文庫的構建

[方法]1．在0．5ml微量離心管內配制以下PCR反應混合液。配制成2個“反應管”，1個含有V。文庫DNA，另1個則含有Vl文庫DNA。反應管對照1對照2●scFV接頭DNA（100ng/ul）1．0ul1．0ul●VH文庫DNA（100ng/ul）3．5ul1．0ul●V-文庫DNA（Vκ或Vλ）（100ng/ul）3．0ul1．0ul●水6．5ul5．5ul2．在每管中加入：●水，33ul●10×Vent緩沖液，5．0ul●20×dNTP，2．5ul3．在熱循環(huán)儀格內加熱反應管到94℃，5分
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29

2012年
12月

再擴增scFv基因文庫以添加限制性位點進行克隆

[方法]1．在0．5ml微量離心管中，配制兩個50/z1PCR反應混合液（1個用于VH—VκscFv文庫，另1個用于Vu—VλscFv文庫），其中含有：●水，36．5//1●10XTag緩沖液，5．0ul●20XdNTP，2．5ul●正向引物，2．0ul●反向引物，2．0ul●scFv基因文庫（約long），1．0ul2．在熱循環(huán)儀格內加熱反應管到94℃，5分鐘。如果沒有加熱蓋，則滴加1滴輕質礦物油覆蓋反應液。3．加入1．0ul（5單位）TdQDNA聚合酶。4．以94℃1分鐘、55℃1分鐘、72
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