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08

2013年
01月

膠體金免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)

①膠體金溶液可以重復(fù)制備，其顆粒大小可以控制，可較容易進(jìn)行免疫電鏡的雙重或多重標(biāo)記；②金標(biāo)探針有很高的電子密度，有特殊的分辨率，定位準(zhǔn)確；③金標(biāo)探針能發(fā)射二次電子和反射電子，是掃描電鏡目前的標(biāo)記物；④金標(biāo)探針與組織細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合后，可用銀增強(qiáng)，大大提高了IHC的敏感性，是目前zui為敏感的IHC方法之一；⑤免疫金銀染色方法無(wú)致癌性，使用較安全。膠體金技術(shù)是以膠體金作為一種標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它具有一般溶膠的特性。溶膠是指一種物質(zhì)以或大或小的微小粒子分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系。被分
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08

2013年
01月

膠體金的一般性狀

（一）膠體金的顏色溶膠的顏色取決于分散相物質(zhì)的顏色、分散相物質(zhì)的分散度和入射光線的種類(lèi)，是散射光線還是透射光，粒子越小，分散度越高，則散射光的波長(zhǎng)越短。對(duì)同一種物質(zhì)的水溶膠來(lái)說(shuō)，粒子大小不同，呈現(xiàn)的顏色亦不同。如膠體金顆粒在5～20nm之間，吸收波長(zhǎng)520nm，呈紅色的葡萄酒色；20～40nm之間的金溶膠主要吸收波長(zhǎng)530nm的綠色光，溶液呈深紅色；60nm的膠體金溶膠主要吸收波長(zhǎng)600nm的橙黃色光，溶液呈藍(lán)紫色。一般應(yīng)用于免疫組織化學(xué)的膠體金顆粒為5～60nm范圍內(nèi)，溶液呈現(xiàn)紅色。在相當(dāng)?shù)囊?/div> 【查看全文】
06

2013年
01月

大規(guī)模連接及純化連接后的DNA

[方法]1．建立以下連接反應(yīng)：●載體DNA（pG6AppG6B，pG6C）（10ug）xul●cDNA片段（3～5ug）yul●10×連接緩沖液40ul●T4DNA連接酶（6WeissU/ul）5ul●水400ul2．在16℃過(guò)夜孵育。3．在70℃孵育30分鐘，使T4DNA連接酶變性。4．加1體積的乙醇并振蕩45秒，在14000g微離心機(jī)中離心10分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的微離心管中。5．加1體積的24/1（體積比）氯仿/異戊醇并振蕩45秒，在14000g微離心機(jī)中離心5分鐘，然后將上清液
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06

2013年
01月

Topl0F’細(xì)胞中的電轉(zhuǎn)化及文庫(kù)儲(chǔ)存

[方法]1．加2～3ul純化的連接反應(yīng)物（zui大值為0.3ugDNA）到80ul的*0F’電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖晃混合。使用30ng（2ul）的pUCl9控制電轉(zhuǎn)化效率。2．將細(xì)胞+DNA懸浮液轉(zhuǎn)移到已冷卻的0．2cm細(xì)胞電轉(zhuǎn)化管，并冰浴3分鐘。3，將GenePulserPlus電穿孔儀設(shè)置為2．5kV脈沖，電容器設(shè)為25uF，脈沖控制器設(shè)為200ns。4．用紙巾干燥電轉(zhuǎn)化管，然后將它放在電轉(zhuǎn)化箱中，使用一個(gè)脈沖（寄存時(shí)間常量必須為4．5～5．0毫秒）。5．立即加lmlLB到電擊管中，打散
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04

2013年
01月

gⅥ-cDNA噬菌粒文庫(kù)小規(guī)模的獲取和純化

[方法]1．將克隆體接種到100ulLBAT96孔培養(yǎng)板上，并在37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)（180r/min）。2．使用96孔復(fù)制板將其接種到裝有200ulLBAT的第二塊96孔培養(yǎng)板上，在37℃培養(yǎng)直到生長(zhǎng)中期（大約1，5小時(shí)）。3．在每一孔中加入10ul2×1011TU/mlR408輔助噬菌體。4．37℃無(wú)振蕩培養(yǎng)30分鐘。5．37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。6．4℃800g離心20分鐘，收集細(xì)胞。7．將上清液轉(zhuǎn)移到一新的96孔培養(yǎng)板上，并加40pulPEG/NaCl。8．將板放置于冰上1小時(shí)。9．4℃800g
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04

2013年
01月

gⅥ-cDNA融合噬菌體ELISA

[方法]1．用200ulPBST沖洗鏈霉素包被的微量濃度測(cè)定板的每個(gè)孔3次。2．在2mol/LPBS中稀釋生物素配體（BAS噬菌體—ELISA）或生物素捕獲抗體（ISA噬菌體—ELISA），直到終濃度為10—50nmol/l，再加100ul這種溶液到農(nóng)度測(cè)定板中的每個(gè)孔中。3．在室溫下孵育濃度測(cè)定板1小時(shí)。4。用200ulPBST沖洗每個(gè)孔5次。5．在2mol/LPBS中稀釋噬菌體溶液到濃度為1×1011TU/ml，在*次用來(lái)稀釋IAS融合噬菌體的2mol/LPBS中加入誘餌血清或預(yù)免疫血清，再
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29

2012年
12月

用scFv接頭PCR裝配VH和VL進(jìn)行scFv基因文庫(kù)的構(gòu)建

[方法]1．在0．5ml微量離心管內(nèi)配制以下PCR反應(yīng)混合液。配制成2個(gè)“反應(yīng)管”，1個(gè)含有V。文庫(kù)DNA，另1個(gè)則含有Vl文庫(kù)DNA。反應(yīng)管對(duì)照1對(duì)照2●scFV接頭DNA（100ng/ul）1．0ul1．0ul●VH文庫(kù)DNA（100ng/ul）3．5ul1．0ul●V-文庫(kù)DNA（Vκ或Vλ）（100ng/ul）3．0ul1．0ul●水6．5ul5．5ul2．在每管中加入：●水，33ul●10×Vent緩沖液，5．0ul●20×dNTP，2．5ul3．在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃，5分
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29

2012年
12月

再擴(kuò)增scFv基因文庫(kù)以添加限制性位點(diǎn)進(jìn)行克隆

[方法]1．在0．5ml微量離心管中，配制兩個(gè)50/z1PCR反應(yīng)混合液（1個(gè)用于VH—VκscFv文庫(kù)，另1個(gè)用于Vu—VλscFv文庫(kù)），其中含有：●水，36．5//1●10XTag緩沖液，5．0ul●20XdNTP，2．5ul●正向引物，2．0ul●反向引物，2．0ul●scFv基因文庫(kù)（約long），1．0ul2．在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃，5分鐘。如果沒(méi)有加熱蓋，則滴加1滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。3．加入1．0ul（5單位）TdQDNA聚合酶。4．以94℃1分鐘、55℃1分鐘、72
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