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28 2013年 02月: 平衡法選擇高親和力噬菌體抗體

1．多樣化的噬菌體抗體丈庫中制備噬菌體抗體。2．根據(jù)廠家說明，對(duì)抗原進(jìn)行生物素化。3．選擇前，在1個(gè)1．5m1微量離心管中．用2％MPBS1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠，室溫1小時(shí)。用磁性試管架將碰珠吸向一側(cè)。棄去緩沖液。4．用2％MPBS封閉3個(gè)1．5m1微量離心管，室溫1小時(shí)；而后，棄去封閉緩沖液。以3個(gè)不同濃度將士物素化抗原（總共3管）與溶于2％MPDS（終濃度）的1m1噬茼體樣品（大約1012c{u／m1）進(jìn)行孵育，室溫振蕩l小時(shí)。對(duì)于*輪選擇，抗原濃度應(yīng)分別為Kd／l、Kd／10以
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28 2013年 02月: 用Biacore儀篩選解離速率較低的scFv

選擇3～5輪后，隨機(jī)挑取克隆加入96孔微量滴定板中并誘導(dǎo)表達(dá)可溶性scFv。然后，在包被有相關(guān)抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的細(xì)菌上清。此過程可以識(shí)別出那些結(jié)合了抗原的scFv。但即便采用上述嚴(yán)謹(jǐn)性選擇后，ELISA陽性克隆中僅有部分克隆的親和力比野生型高。ELISA信號(hào)強(qiáng)度不能很好地顯示哪個(gè)克隆具有較低的Ka值，而且更為普遍的是它與scFv表達(dá)水平相關(guān)。因此，這就需要一種篩選ELISA陽性克隆的技術(shù)，能識(shí)別出具有較低Ka值的克隆。競爭性或抑制性ELISA就是這樣的
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26 2013年 02月: 鞣酸—檸檬酸鈉還原法制備膠體金分散顆粒

A液（80ml）：1％氯化金，lml；雙重蒸餾水，79ml。B液（20m1）：1％檸檬酸鈉，4ml；1％單寧酸，0.lml；雙重蒸餾水，15．8ml。25mmol/LK2C03，0．1ml；將上述A液加熱到60℃，然后將B液快速加入到A液中，繼續(xù)攪拌，在極短的時(shí)間內(nèi)加熱到煮沸（大約10min），此時(shí)顏色由黑一藍(lán)一亮紅（近似紅葡萄酒顏色）變化。pH調(diào)到所需要求（根據(jù)所標(biāo)記蛋白質(zhì)種類的不同，所需的pH也不一樣）。上述用量合成的膠體金為10nm，根據(jù)所加入鞣酸（或稱單寧酸）量的不同，可合成3—17nm
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26 2013年 02月: 制備膠體金分散顆粒的其他方法

乙醇—超聲波還原法（Baigent和Muller，1980）（1）取1％AuCl3·HCl水溶液lml加入100ml雙重蒸餾水。（2）用0．2m01/LK2C03調(diào)pH至7．2，再加入lml無水乙醇。（3）用20KC、135W超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進(jìn)行超聲振蕩，此法制備的顆粒為6～10nm。硼氫化鈉還原法（Tschopp等，1982）（1）取0．6ml1％氯化金水溶液，加入40ml預(yù)冷（4℃）雙蒸餾水。（2）再加入0．2mol/LK2C030．2ml。（3）邊攪拌邊加入新鮮配制的硼氫化鈉水溶液（0
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23 2013年 02月: 生物實(shí)驗(yàn)室安全

『安全』是進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)zui重要的考量，若不留意，經(jīng)常會(huì)造成*的遺憾，因此，請(qǐng)遵守以下各項(xiàng)規(guī)定：1.請(qǐng)事先勘查緊急沖洗站、洗眼臺(tái)及滅火器的位置。2.請(qǐng)避免穿著涼鞋或拖鞋（腳趾不要裸露），并請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)衣。留長發(fā)者，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前將頭發(fā)束好。3.在實(shí)驗(yàn)室請(qǐng)勿吸煙、化妝、嚼口香糖、吃東西、喝飲料。食物不可存放于實(shí)驗(yàn)室的冰箱中。4.實(shí)驗(yàn)前后請(qǐng)將工作區(qū)域清理擦拭干凈，實(shí)驗(yàn)中打翻任何藥品試劑時(shí)，要隨時(shí)清理；離開實(shí)驗(yàn)室前請(qǐng)記得洗手。5.使用刻度吸管時(shí)，切勿用嘴吸取，請(qǐng)用安全吸球或吸管唧筒。6.不論近視與否，能自
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23 2013年 02月: 微量移液器之拆解與組裝方法步驟

微量移液器（micropipet）是進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)或分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的*工具，然而使用方法的正確與否，以及微量移液器的準(zhǔn)確性，都直接影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，故請(qǐng)對(duì)你持有之微量移液器作深入的認(rèn)識(shí)。本實(shí)驗(yàn)室所使用的微量移液器為GilsonPipetmanP系列，包括P1000,P200,P20等。以下使用方法及注意事項(xiàng)，部份取材自原廠所附說明書，請(qǐng)?jiān)斪x之后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1）請(qǐng)參照?qǐng)D1.1，認(rèn)識(shí)微量移液器每一部份組件之位置及名稱。2）將D（ejector）取下，C（connectingnut）旋開；旋開時(shí)要
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21 2013年 02月: 瓊脂糖膠體電泳（agarose gel electrophoresis）

儀器用具：迷你電泳槽及鑄膠器（MupidII）；UVtransilluminator及影像分析系統(tǒng)；防護(hù)面罩藥品試劑：瓊脂糖粉末（agarose,lowEEO）1×TAE電泳緩沖液（40mMTris-acetate,1mMEDTA,pH8.0）：由50×TAE（每1L含242gTrisbase,57.1mLglacialaceticacid,100mL的0.5MEDTA-8.0）稀釋使用。10×追蹤染劑（0.25%bromophenolblue,0.25%xylenecyanol,0.1MEDT
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21 2013年 02月: DNA限制酶分析與切割

儀器用具：37℃及65℃水浴或恒溫槽藥品試劑：質(zhì)體pBluescriptIISK（-）限制酶：BamHI,PvuII及ScaI（濃度均為10units/μL,Invitrogen）10×Reactionbuffer6（0.5MTris-HCl,pH7.4;60mMMgCl2;0.5MNaCl;0.5MKCl）無菌水方法步驟：1）取7支微量離心管，依下表所列體積（單位μL）依序加于管壁不同位置上?！裘看挝∠拗泼笗r(shí)，請(qǐng)換一支新的微量移液器頭以免造成污染?？傮w積為20μL，短暫離心后，以微量移液器頭
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