如何完成一次又經(jīng)濟(jì)的Tunel檢測？

——Yeasen TUNEL detection Kit 讓“美”原位呈現(xiàn)

通過TdT轉(zhuǎn)移酶將Fluorescein-dUTP結(jié)合到有缺口的DNA上是檢測細(xì)胞凋亡的常用方法之一，如Roche提供的In Situ Cell Death Kit正是基于這個原理。產(chǎn)品中的TdT轉(zhuǎn)移酶活性直接影響到標(biāo)記的效率。翊圣生物立足于酶制劑生產(chǎn)，力求開發(fā)以酶制劑為基礎(chǔ)的產(chǎn)品，推出三款熒光素（Alexa Fluor 640，Alexa Fluor 488，FITC）標(biāo)記的Tunel檢測試劑，在滿足客戶對產(chǎn)品高品質(zhì)要求的同時又可以享受低至Roche一半的價格。

目前已經(jīng)有超過120個課題組正在使用該產(chǎn)品，并在雜志上發(fā)表多篇英文文章，如Theranostics和EMBO Molecular Medicine等。

檢測機(jī)理：

細(xì)胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移（TdT）的作用下，將熒光素/酶標(biāo)記的dUTP結(jié)合到DNA的3-末端，從而可通過檢測熒光完成對細(xì)胞凋亡的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal-Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL），原理見圖1。

圖1：脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）原理圖

產(chǎn)品特點:

適用范圍廣：可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞。

檢測靈敏度高：可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞。

背景干擾?。?/span>信噪比高。

觀察多樣性：熒光顯微鏡觀察，流式檢測。

數(shù)據(jù)展示：

1、小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L）Tunel檢測

圖2：小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L凋亡檢測。行代表陰性對照，第二行代表陽性對照。

檢測試劑：Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

2、石蠟切片樣本的Tunel檢測

圖3：在皮下移植瘤模型中，單獨使用LY3009120或聯(lián)合使用Vemurafenib和Obatoclax可以有效延緩甲狀腺癌[5]。IF=8.8

樣本類型：石蠟包埋的腫瘤組織（取自裸鼠）。檢測試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)。

3、細(xì)胞爬片的Tunel檢測

圖4：硫酸鋅對不同分組的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響^[11] 

樣本類型：HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）。檢測試劑：Cat No. 40308 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 640)

4、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

圖5：PA處理可以有效降低重編程（reprogramming）過程中凋亡的發(fā)生^[9]。IF=3.7

樣本類型：iPS Cells。檢測試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)。

文獻(xiàn)引用：

[1] Li C, Wang Q, Gu X, et al. Porous Se@ SiO2 nanocomposite promotes migration and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cell to accelerate bone fracture healing in a rat model[J]. International Journal of Nanomedicine, 2019, 14: 3845. (IF 4.76)

[2] Miao T, Qian L, Yu F, et al. Protective effects of hydroxysafflor yellow an on high oxidized low density lipoprotein induced human coronary artery endothelial cells injuries[J]. Development, 2019, 22: 581-589.(IF 6.208 )

[3] Wen Y, Liu G, Zhang Y, et al. MicroRNA-205 is associated with diabetes mellitus‐induced erectile dysfunction via down-regulating the androgen receptor[J]. Journal of cellular and molecular medicine, 2019, 23(5): 3257-3270.(IF 4.41)

[4] Xu T, Ding W, Ao X, et al. ARC regulates programmed necrosis and myocardial ischemia/reperfusion injury through the inhibition of mPTP opening[J]. Redox Biology, 2019, 20: 414-426.(IF 8.37)

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[11] Li G, Yin Q, Ji H, et al. A study on screening and antitumor effect of CD55-specific ligand peptide in cervical cancer cells[J]. Drug Design, Development and Therapy, 2018, 12: 3899.(IF 3.27)

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[14] Liu Y, Zhi X, Hou W, et al. Gd3+-Ion-induced carbon-dots self-assembly aggregates loaded with a photosensitizer for enhanced fluorescence/MRI dual imaging and antitumor therapy[J]. Nanoscale, 2018, 10(40): 19052-19063.(IF 7.17)

 [15] Liu Q, Qian Y, Li P, et al. 131 I-labeled copper sulfide-loaded microspheres to treat hepatic tumors via hepatic artery embolization[J]. Theranostics, 2018, 8(3): 785.(IF 8.12 )

常見問題：

Q:出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記？

1）組織/細(xì)胞本身核酶或聚合酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記，例如平滑肌細(xì)胞。解決方法是，取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。

2）使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?，例如一些酸性固定液，?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。建議采用新鮮配置的4%中性對聚甲醛固定液。

3）TUNEL檢測反應(yīng)時間過長，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時間，并確保TUNEL檢測反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。

Q:熒光背景很高？

1）高速分裂和增殖的細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄水平高，有時也會出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。

2）在激發(fā)光下長時間的暴露，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。

Q:標(biāo)記效率低？

1）使用乙醇或甲醇固定會導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。

2）固定時間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。此時宜減少固定時間。

3）組織切片過厚，使得固定效果不理想，控制在10 μm以內(nèi)。

4）熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10min就會嚴(yán)重淬滅。解決方法是需注意避光操作。

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