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CUT&Tag高能出擊
——看ChIP-Seq的進化形態(tài)如何玩轉實驗!
表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變，即基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變。表觀遺傳調控是指基因的表達水平受各種修飾的影響，其分子基礎有兩個方面，即針對DNA本身的修飾和對組蛋白的修飾。蛋白質與DNA相互作用是基因轉錄調控的關鍵，也是基因轉錄啟動的前提。傳統蛋白質DNA互作研究常用的有凝膠阻滯，酵母雜交，ChIP-Seq等，其中ChIP-Seq可以完整的反映與靶蛋白結合的DNA序列，是蛋白質與DNA互作的經典方法。
但是近年來CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagment）作為一種新興的DNA蛋白互作研究技術，憑借其信噪比高，可重復性好，實驗周期更快等優(yōu)勢，在植物以及動物細胞中的成功應用，相關科研成果也陸續(xù)發(fā)表[1-2]，受到廣大科研工作者的信賴。
2009年，Dominic Schmidt等將ChIp與當時熱門技術NGS結合，成就了ChIP-Seq技術，從而能夠在全基因組范圍內檢測與蛋白相互作用的DNA區(qū)域。
1.ChIP-Seq
1） 實驗原理
甲醛處理細胞使目標蛋白與DNA交聯，通過超聲波將交聯后的染色質打斷成小片段，一般在200-600 bp范圍內，再利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，純化之后進行文庫的構建并測序。
2）實驗流程
圖1. ChIP-Seq實驗流程
3）實驗難點
? 時間長，一次實驗需要2~3天，且操作誤差對實驗結果影響大；
? 起始的細胞需求量大，需要107個細胞，且背景噪音較高；
? 甲醛交聯與免疫共沉淀需根據經驗控制時間，會造成非特異結合增加；
? 對抗體的特異性要求高，需要ChIP級別的抗體。
2019年，Henikoff實驗室發(fā)明了CUT&Tag，使用ProteinA/G-Tn5從而簡化了二代測序的步驟，并且極大降低了細胞的起始數量。
2.CUT&Tag
1）實驗原理
CUT&Tag是蛋白質與DNA互作的革新技術，無需通過甲醛交聯以及免疫共沉淀，其核心技術為pA/G-Tn5 Transposase，將Protein A/G與Tn5轉座酶進行融合，使得與抗體結合的同時，Tn5切割核小體上纏繞的DNA片段，獲得目的序列。
圖2. CUT&Tag原理圖
2）實驗流程
利用連有刀豆蛋白A的磁珠（ConA）結合細胞（與細胞膜上的糖蛋白結合）并利用洋地黃皂苷進行細胞膜通透，接著孵育靶蛋白的抗體，二抗以及Protein A/G Tn5?？贵w和Protein A/G與Tn5能夠進入細胞核，Tn5此時在Protein A/G的幫助下切割靶蛋白附近的DNA序列，由于Tn5是經過修飾的，切割的同時會在片段的兩端加上一部分Adapter序列，再通過PCR文庫擴增可得到對應的文庫進行測序。
圖3. CUT&Tag實驗流程
3）技術優(yōu)勢
? 流程簡便：無需甲醛交聯、超聲打斷、免疫共沉淀，無需補平，加A和接頭；
? 可視化操作：利用ConA beads結合細胞，操作可視化；
? 磁珠回收：片段化后DNA磁珠回收基因組DNA，簡化操作，減少雜質引入；
? 特異性好：抗體與靶蛋白特異性結合進行目標區(qū)域定位；
? 起始量低：所需細胞數10^7下降到10^2，甚至可以做單細胞水平研究；
? 性價比高：無需ChIP級別抗體，背景噪音低，所需測序深度少；
? 重復性好：實驗重復結果一致性好。
Henikoff等通過三種方法來對組蛋白H3K27me3進行研究，在相同的數據量（8M Reads）情況下，三種方法的染色體景觀相似，但ChIP-Seq的背景較高，CUT&Tag的信號更強，信噪比更高。
圖4. CUT&Tag、CUT&RUN（Henikoff于2017年發(fā)明了新技術）的peaks鑒定結果與ChIP-Seq的對比(Henikoff,2019)
同時CUT&Tag可以對極少量細胞（60個細胞）進行操作，實現單細胞測序。Protein A-Tn5在細胞內進行核酸切割，PCR之前的反應都在細胞內進行。Henikoff博士通過分配單個細胞到5184納米孔，再加入帶隨機標簽的引物進行擴增的辦法，實現單細胞測序。
圖5. 單細胞CUT&Tag測序流程(Henikoff,2019)
翌圣生物CUT&Tag試劑盒相較于傳統的ChIP-seq，優(yōu)化了反應體系和實驗操作流程，文庫時間更短（僅需7小時），起始樣本要求更低，抗體投入量更少，文庫產量更高等優(yōu)點，是蛋白質-DNA互作研究技術的又一創(chuàng)新。
1.更高的文庫質量。
圖6. 文庫質檢圖
2.更優(yōu)異的數據質量。
圖7.測序數據對比圖
3.更高的信噪比
圖8.信噪比展示
產品名稱 | 產品編號 | 規(guī)格 |
Hieff NGS® G-Type In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® 原位DNA結合圖譜測序建庫試劑(Protein A/G親和抗體) | 12598ES04 | 4T |
12598ES12 | 12T | |
12598ES48 | 48T |
[1]. Dan Lu, Liu L, Sun Y, Song J, Yin Q, Zhang G, Qi F, Hu Z, Yang Z, Zhou Z, Hu Y, Zhang L, Ji J, Zhao X, Jin Y, McNutt MA, Yin Y. The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity. Nat Immunol. 2020 Mar;21(3):287-297. doi: 10.1038/s41590-019-0577-9. Epub 2020 Jan 13. PMID: 31932812.
[2]. Tao X, Feng S, Zhao T, Guan X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 2020 Aug 31;16:120. doi: 10.1186/s13007-020-00664-8. PMID: 32884577; PMCID: PMC7460760.
[3]. Kaya-Okur, H. S., Wu, S. J., Codomo, C. A., Pledger, E. S., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., ... & Henikoff, S. (2019). CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature communications, 10(1), 1930.
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