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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：1.1提取高品質(zhì)RNA
RNA提取是RT-qPCR實(shí)驗(yàn)成功的首要步驟，RNA的質(zhì)量直接關(guān)乎RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們經(jīng)常會(huì)碰到RNA提取實(shí)驗(yàn)翻車的情況，主要是因?yàn)镽NA的分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和無(wú)處不在的RNase對(duì)RNA的降解造成的。
由此可見(jiàn)，想要提取到高質(zhì)量的RNA并非易事。今天，小翌主要從樣本選擇、樣本采集與保存、RNA提取這三個(gè)方面來(lái)闡述RNA提取過(guò)程需注意的關(guān)鍵要點(diǎn)，以輔助后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。
樣本的選擇
樣本最好選擇處于生長(zhǎng)旺盛期的新鮮細(xì)胞，新鮮、生長(zhǎng)旺盛的動(dòng)物組織，新鮮幼嫩的植物組織。
樣本采集和保存
注：Trizol為裂解液，可用于保存細(xì)胞，但不適用于組織樣本保存。當(dāng)細(xì)胞存放在Trizol中需注明每管的細(xì)胞數(shù)量。
其他Tips
常見(jiàn)的RNA提取方法
1. 沉淀法
? 原理
Trizol中含有苯酚、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇，可裂解樣本釋放核酸，并抑制RNase活性。加入氯仿離心分層，收集上清，經(jīng)異丙醇沉淀得到總RNA
Trieasy (貨號(hào)：10606)
2. 離心柱法
? 原理
高鹽吸附、低鹽洗脫
? 特點(diǎn)
培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒(貨號(hào)：19231）
組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒（貨號(hào)：19221）
多糖多酚植物RNA提取試劑盒（貨號(hào)：19292）
在此，給大家介紹一款11min即可完成培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取的的柱式提取試劑盒：培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒（19231）。
? 產(chǎn)品特點(diǎn)：
? 案例展示：
使用培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒（19231）和O品牌常規(guī)細(xì)胞/組織RNA提取試劑盒各提取2份293T細(xì)胞（10^6個(gè)細(xì)胞）的總RNA。結(jié)果顯示，該試劑盒提取到的目標(biāo)RNA產(chǎn)量一致，但純度更高，如表1和圖2。
表1. Nanodrop測(cè)定RNA濃度
備注：Y1，Y2代表培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒（19231）；O1，O2代表O品牌常規(guī)細(xì)胞/組織RNA提取試劑盒
▲ 圖2a.hGAPDH擴(kuò)增結(jié)果
▲ 圖2b.hBC6擴(kuò)增結(jié)果
圖2. 培養(yǎng)細(xì)胞RNA提取試劑盒的定量結(jié)果與O品牌基本一致。取1 μL洗脫液反轉(zhuǎn)錄，以cDNA的10倍稀釋液為模板，定量測(cè)試 hGAPDH 和 hBC6 2個(gè)基因
綜上，小翌從樣本選擇、樣本采集與保存、RNA提取這三個(gè)方面闡述了提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵要點(diǎn)，下期小翌將講解RNA質(zhì)量評(píng)估以及RNA降解對(duì)qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響等方面的內(nèi)容，我們下期不見(jiàn)不散~
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