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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：如何評估RNA質(zhì)量？
RNA濃度評估
首先我們先來復習一下OD260、OD280、OD230的含義。核酸分子所含的嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵，在260nm波長處有最大吸收峰，因此，核酸的最大吸收波長為260nm，但它無法區(qū)分出DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸等雜質(zhì)；蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結構，通常在280nm處有最大吸收峰；而碳水化合物，多肽，苯酚、EDTA等污染物的最大吸收峰則在230nm處，如圖1。
圖1. 核酸、蛋白質(zhì)、污染物的最大吸收峰（圖源網(wǎng)絡）對于RNA的濃度來說，根據(jù)朗伯-比爾定律可計算出在波長260nm的紫外線下，1個OD值的光密度大約相當于40µg/ml的RNA[1]，即RNA的濃度（µg/µl）= OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000。比如OD260為0.16，2µl樣本稀釋至200µl，即稀釋倍數(shù)為100，RNA的濃度（µg/µl）= 0.16×40×100/1000µg/µl=0.64µg/µl。
RNA純度評估
1）OD260/280<1.8，可能有蛋白質(zhì)或基因組的殘留；
由圖2可看出，若泳道上部有明顯的高分子量雜帶，則可能是有DNA的殘留，不建議用于后續(xù)的qPCR實驗，會對實驗的準確性造成影響（圖2左）；若在膠孔處有比較亮的著色成分，則是有蛋白質(zhì)的殘留（圖2右）。
RNA完整性評估
除了濃度、純度外，RNA完整性也是判斷RNA質(zhì)量的重要指標。RNA完整性一般可通過瓊脂糖凝膠電泳來進行評估。總RNA中占比達80%以上的是核糖體RNA（rRNA），因此，膠圖呈現(xiàn)的結果主要是rRNA。
對于真核生物來說，高質(zhì)量的RNA通常有三條帶，最亮的是28S，其次是18S，最淡的是5S。28S條帶亮度應為18S條帶亮度的2倍(圖3左)，若RNA呈現(xiàn)彌散狀，表明RNA已降解（圖3右）。
小翌在與小伙伴交流的過程中發(fā)現(xiàn)，很多實驗室沒有跑RNA瓊脂糖凝膠電泳的習慣，也不清楚RNA的電泳需注意哪些要點，小翌在此做些科普：
2）緩沖液和瓊脂糖凝膠都需新配制，采用RNase-free H2O配制電泳緩沖液；
3）關于marker的選擇，建議使用RNA marker；
4）RNA電泳宜使用高電壓短時間的方法，以防電泳過程中RNA的降解。
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【1】Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.
