非特異擴(kuò)增是PCR實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題，非特異擴(kuò)增直接影響檢測(cè)結(jié)果的判讀并且會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增靈敏度下降，甚至目標(biāo)片段的得率下降等。此外，檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性也是核酸檢測(cè)行業(yè)人格外關(guān)注的問(wèn)題，不管是長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性還是短期偏離正常保存條件的穩(wěn)定性，都直接影響檢測(cè)結(jié)果的有效性。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱“翌圣生物"）匠心開(kāi)發(fā)出熱啟動(dòng)Taq酶雙封閉抗體，通過(guò)同時(shí)封閉Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性來(lái)有效提高擴(kuò)增的特異性及試劑的穩(wěn)定性。

傳統(tǒng)的Taq DNA聚合酶抗體可以有效抑制Taq酶的聚合酶活性，從而避免錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。然而Taq酶除了具有5'→3'聚合酶活性，還有5'→3'核酸外切酶活性，這部分外切酶活性可能會(huì)在低溫時(shí)導(dǎo)致錯(cuò)配探針或其它物料降解，造成非特異信號(hào)。翌圣生物開(kāi)發(fā)的熱啟動(dòng)Taq酶雙封閉抗體不僅可以封閉Taq酶的有5'→3'聚合酶活性，還能同時(shí)封閉Taq酶的5'→3'外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，又能防止物料降解產(chǎn)生非特異信號(hào)，雙重提升試劑的穩(wěn)定性。

圖1. 翌圣雙封閉抗體封閉原理示意圖

圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結(jié)構(gòu)域和5'→3'核酸外切酶活性結(jié)構(gòu)域，翌圣雙封閉抗體含兩種抗體，可同時(shí)封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性

翌圣生物Taq酶雙封閉抗體不僅可封閉野生型Taq酶，對(duì)于多種突變體Taq酶亦可適用，封閉之后的熱啟動(dòng)Taq酶可以正常保存至-20℃。

1 µL抗體（5 mg/mL）可封閉20-50 U Taq DNA聚合酶：

•  小樣室溫（25℃）旋轉(zhuǎn)混勻孵育30 min

•  大樣室溫（25℃）旋轉(zhuǎn)混勻孵育2~3 h

 1  雙封閉抗體有效封閉Taq DNA聚合酶外切酶活性

將合成的引物探針?lè)謩e配于未封閉以及雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶的反應(yīng)液中，40℃反應(yīng)，檢測(cè)兩者熒光信號(hào)。

圖2. 雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測(cè)

黃色：未封閉的Taq DNA聚合酶組；紫色：雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶組

由圖2可以看出雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

 2   使用雙封閉抗體分型準(zhǔn)確，靈敏度更高

分別用翌圣生物雙封閉抗體以及T公司抗體對(duì)Taq酶封閉后通過(guò)ARMS-PCR技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性樣本。

圖3. ARMS-PCR擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色：T公司封閉抗體封閉；紅色：翌圣雙封閉抗體封閉

由圖3可以看到翌圣生物雙封閉抗體封閉的Taq酶在ARMS-PCR擴(kuò)增中分型準(zhǔn)確，靈敏度更高。

 3   雙封閉抗體有效提升檢測(cè)試劑穩(wěn)定性

用傳統(tǒng)封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預(yù)混液，在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天，擴(kuò)增10000拷貝ASFV質(zhì)粒，觀察擴(kuò)增曲線和Ct值變化，對(duì)比傳統(tǒng)封閉抗體和雙封閉抗體對(duì)全預(yù)混反應(yīng)液穩(wěn)定性的作用。

圖4. 傳統(tǒng)封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASFV質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色：4℃放置10天；紅色：4℃放置0天（對(duì)照）

由圖4可以看出，雙封閉抗體比傳統(tǒng)封閉抗體更能保持反應(yīng)液穩(wěn)定，有效提升檢測(cè)試劑穩(wěn)定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預(yù)混液4℃放置10天擴(kuò)增曲線和Ct值無(wú)明顯變化。

圖5. 傳統(tǒng)封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASFV質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色：37℃放置5天 ；綠色：37℃放置3天；黃色：37℃放置1天 ； 紅色：37℃放置0天（對(duì)照）

由圖5可以看出，雙封閉抗體比傳統(tǒng)封閉抗體更能保持反應(yīng)液穩(wěn)定，有效提升檢測(cè)試劑穩(wěn)定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預(yù)混液37℃放置1、3、5天Ct值差小于0.2。

 4   雙封閉抗體幫助解決基線上漂問(wèn)題

某些引物配合特定buffer和儀器時(shí)，會(huì)出現(xiàn)基線上漂的情況。翌圣生物嘗試多種方法改善基線問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)雙封閉抗體更有利于基線平穩(wěn)。

圖6. N基因(A)、ACT基因(B)擴(kuò)增曲線圖

紅色：傳統(tǒng)封閉抗體封閉；綠色：雙封閉抗體封閉

由圖6可以看出特定引物和buffer下，使用雙封閉抗體可幫助解決基線上漂問(wèn)題。

 5   使用雙封閉抗體獲得良好線性

用雙封閉抗體封閉的反應(yīng)液擴(kuò)增100000、10000、1000、100拷貝ASFV/ACT雙質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7. 雙封閉反應(yīng)液制作ASFV基因(A)、ACT基因(B)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖7可以看到，ASFV基因標(biāo)準(zhǔn)曲線R²為0.998，擴(kuò)增效率為98.848%；ACT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線R²為0.998，擴(kuò)增效率為98.113%，兩者線性均良好，且均無(wú)非特異性擴(kuò)增。

 6   雙封閉抗體可快速釋放酶活

分別用進(jìn)口T公司抗體和翌圣生物雙封閉抗體封閉Taq酶，并在95℃下熱激20 s，檢測(cè)酶活?？梢钥吹?5℃熱激 20 s后，翌圣生物雙封閉抗體可釋放95%以上的酶活，與T公司抗體相當(dāng)。

 7   雙封閉抗體可封閉多種類型Taq酶

用翌圣生物雙封閉抗體（Cat#31303）分別封閉三種類型Taq酶（野生型+2種突變型），封閉比例為1μg：5U，測(cè)量熒光值以及封閉效率?？梢钥吹剑瑢?duì)于不同類型的Taq酶，翌圣生物雙封閉抗體（Cat#31303）封閉效果均較好。

 8   Yeasen雙封閉抗體無(wú)小鼠基因組殘留

以水為模板作為陰性對(duì)照，小鼠基因組為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增不同批次的31303，觀察條帶，發(fā)現(xiàn)樣品未擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明抗體不存在小鼠基因組殘留。

圖8. 小鼠基因組殘留檢測(cè)圖

注：-為陰性對(duì)照，+為陽(yáng)性對(duì)照，1-5為31303不同批次樣品

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