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TaqMan探針法qPCR原理及其主要應(yīng)用

2021-11-12　　閱讀(4792)

TaqMan探針法qPCR原理及其主要應(yīng)用

實時熒光定量PCR（簡稱qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行定量分析的方法。根據(jù)所用熒光化學(xué)物質(zhì)的不同，qPCR可分為熒光染料法（SYBR Green Ⅰ法為代表）和熒光探針法（TaqMan法為代表）。

SYBR Green Ⅰ染料法因具有使用簡便，價格便宜等優(yōu)點而被廣泛使用。但其最大的缺點是缺乏特異性，即染料可以與任何dsDNA結(jié)合。因此，qPCR反應(yīng)中有非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)會增加熒光值，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，而TaqMan探針法的出現(xiàn)很好地解決了染料法非特異性的問題。下面，我們一起來了解一下TaqMan探針法qPCR的基本原理及其主要應(yīng)用。

PART 01

TaqMan探針法qPCR原理

TaqMan探針法qPCR是使用TaqMan熒光探針進行熒光檢測的方法。其基本原理是PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'核酸外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，通過檢測PCR反應(yīng)體系中的熒光強度可以達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。

圖. TaqMan水解探針作用機理圖

PART 02

TaqMan探針法qPCR優(yōu)點

1 特異性高、定量準(zhǔn)確

從原理可以看出，熒光探針只與目的序列結(jié)合，理論上探針法的熒光信號只來源于目的序列，即不受非特異性產(chǎn)物的影響，因此，TaqMan探針法qPCR的特異性非常高，定量準(zhǔn)確。

2 實驗耗時短

因探針法qPCR的高特異性，故無需再設(shè)置熔解曲線檢測擴增產(chǎn)物的特異性如何，大大縮短了實驗時間。

3 兼容多重反應(yīng)

不同波長的熒光報告基團可以標(biāo)記不同的探針，因此可以在同一個反應(yīng)體系中利用不同熒光標(biāo)記的探針同時檢測多個靶標(biāo)，達到節(jié)省實驗成本的目的。

PART 03

TaqMan探針法qPCR主要應(yīng)用

正是由于上述優(yōu)點，TaqMan探針法qPCR已被廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐之中。有基礎(chǔ)生物學(xué)研究、食品檢測、醫(yī)學(xué)檢測與診斷等,尤其是在醫(yī)學(xué)檢測和診斷方面得到了大力地推廣。因此本文重點介紹其在醫(yī)學(xué)檢測與診斷方面的應(yīng)用。

1 核酸定量分析

Taqman qPCR技術(shù)可對傳染性疾病進行定量定性分析，包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。

2 基因表達差異分析

在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的許多研究領(lǐng)域，從基礎(chǔ)科學(xué)研究到藥物研究的實際應(yīng)用，檢測基因表達情況都是基本的也是很重要的工作。Taqman qPCR技術(shù)可比較經(jīng)過不同處理(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)樣本之間特定基因的表達差異，特定基因在不同時相的表達差異。

3 基因型/等位基因分析

單核苷酸多態(tài)性（SNPs）是由DNA序列中同一個位置上的堿基對的常見替換造成的個體DNA序列差異。SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義。

與傳統(tǒng)基因型分析方法相比，Taqman qPCR技術(shù)具有高效率，低交叉污染等多方面優(yōu)勢，已成為SNP分型應(yīng)用中方法之一。

4 藥物開發(fā)研究

在新藥的開發(fā)過程中，快速了解藥物對疾病進程的影響可以為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力、時間和資金。

與以前所用的Elisa等方法相比，TaqMan qPCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量，為比較不同配方的療效、用藥量、用藥時間等提供快速、準(zhǔn)確的評價。

5 無創(chuàng)產(chǎn)前檢查

到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產(chǎn)前診斷，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生。

例如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，可從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用TaqMan qPCR檢測其Y性別決定區(qū)基因。此外還可以通過TaqMan qPCR對孕婦弓形蟲，梅毒等進行檢測，這對找出不明原因流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)的病因提供有力的幫助，大大提高優(yōu)生優(yōu)育。

6 腫瘤基因檢測

盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。

TaqMan qPCR是一種有效的腫瘤前期檢測及伴隨診斷技術(shù)，涵蓋癌癥惡性腫瘤的預(yù)防及治療。它不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達量。

目前用此方法已進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達檢測。

7 病原體檢測

Taqman qPCR可以對多種病原體（如人類乳頭瘤病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒及非洲豬瘟病毒）進行定量測定。該技術(shù)對病原體的檢測解決了免疫學(xué)檢測的“窗口期"問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)，適用于傳染病早期的大規(guī)模確診。

Taqman qPCR還可對病毒分型，例如可以鑒定特殊的HPV型別以及變異株，并對其進行針對性的處理，更有效預(yù)防宮頸癌。

此外，Taqman qPCR還可確定病毒載量。在抗病藥物治療監(jiān)測的過程中，病毒載量是判斷藥物療效的重要指標(biāo)。如HIV的藥物載量測定需通過Taqman qPCR技術(shù)來測定血液中HIV RNA的量，通過藥物載量的高低變化可幫助判斷HIV藥物效果。

PART 04

翌圣生物Taqman qPCR Mix在非洲豬瘟病毒檢測的應(yīng)用

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染家豬或野豬引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，其發(fā)病率和死亡率可達100%，嚴(yán)重危害著全球養(yǎng)豬業(yè)，造成難以估量的經(jīng)濟損失。

目前非洲豬瘟沒有疫苗和有效的治療手段，qPCR法是OIE推薦使用的非洲豬瘟常規(guī)診斷的重要工具，也是中國在現(xiàn)階段非洲豬瘟流行情況下的檢測技術(shù)。

翌圣生物作為深耕于上游生命科學(xué)領(lǐng)域酶制劑的供應(yīng)商，長期為IVD企業(yè)提供高品質(zhì)、高性價比的原料（含可凍干原料），積極應(yīng)對非洲豬瘟疫情，助力非洲豬瘟高效檢測。

Hieff Unicon^® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix（Cat#11211）

2×Mix預(yù)混合試劑，含有基因改造的抗體法熱啟動Taq酶及深度優(yōu)化的多重反應(yīng)緩沖體系，可極大地提高擴增靈敏度和特異性。

產(chǎn)品特點：

• 優(yōu)異的擴增靈敏度： 3 copies/反應(yīng)可穩(wěn)定檢出

• 超強的存儲穩(wěn)定性：4℃、25℃、37℃放置7天，反復(fù)凍融50次均性能穩(wěn)定

• 精密度高：CV＜1%

• 多平臺適用：適用于市售各種熒光定量PCR儀

• 支持多重檢測：每孔反應(yīng)至多可檢測4-5個靶標(biāo)

部分性能展示：

超高靈敏度，3 copies/反應(yīng)穩(wěn)定檢出

圖. 使用ASFV引物探針，對ASFV質(zhì)粒(終體系3 copies)進行20個復(fù)孔的檢測,比較各個品牌試劑的檢出率，可以看到Y(jié)easen qPCR mix的檢出率更高。

PART 05

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品類型	產(chǎn)品描述	產(chǎn)品名稱	貨號
探針法qPCR試劑	超高靈敏度	Hieff Unicon^® Universal TaqMan multiplex qPCR master mix	11211ES
	全預(yù)混穩(wěn)定性優(yōu)化版（含UDG）	Hieff Unicon^® C55P1 TaqMan Multiplex qPCR Master Mix (UDG plus)	13171ES
	高GC含量擴增子擴增	Hieff Unicon^® TaqMan multiplex qPCR master mix	11208ES
	可凍干試劑盒	Hieff Unicon Lyo-TaqMan Multiplex qPCR Kit	13695ES