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腫瘤篩查診斷之DNA甲基化檢測(cè)
腫瘤是影響人類健康生活的重大疾病之一，隨著人類平均壽命的延長(zhǎng)，惡性腫瘤對(duì)人類的威脅日漸增加。隨著疾病譜的改變，惡性腫瘤已經(jīng)成為導(dǎo)致死亡的主要原因之一。甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要的修飾，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和關(guān)閉，與癌癥、衰老等許多疾病密切相關(guān)。
惡性腫瘤與腫瘤早篩
全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡人數(shù)現(xiàn)狀
根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）等發(fā)布的《2020年全球癌癥數(shù)據(jù)》顯示，2020年全球新發(fā)惡性腫瘤病例1929萬例，死亡病例996萬例，其中中國癌癥新發(fā)病例456.9萬例，死亡病例300.3萬例，分別占全球新發(fā)與死亡病例的23.7%與30.2%。我國新發(fā)惡性腫瘤人數(shù)和惡性腫瘤死亡人數(shù)均位居。
圖1. 2020年全球癌癥新發(fā)病例以及死亡病例分布（數(shù)據(jù)來源于IARC，東吳證券研究所）
腫瘤早篩可顯著提高患者生存率
對(duì)于腫瘤來說，目前防治策略就是早篩早診，即早篩查、早診斷、早治療。結(jié)直腸癌是中國發(fā)病數(shù)的癌種，以結(jié)直腸癌為例，其10年疾病發(fā)展期可分為癌前病變、結(jié)直腸癌I期、II期、III期、IV期，診斷時(shí)各自的5年生存率分別為100%、91.8%、82.4%、57%和10.8%。
由此可見，腫瘤的早篩早診對(duì)于提升患者的生存率至關(guān)重要。根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)，1/3的癌癥可以通過早期發(fā)現(xiàn)得到治療。
圖2. 結(jié)直腸癌疾病發(fā)展期示例（引自諾輝健康招股書）
DNA甲基化與腫瘤
DNA甲基化
DNA甲基化是基因表觀遺傳學(xué)修飾的一種重要方式，是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學(xué)修飾過程。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）島5′端胞嘧啶上，生成為5′甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, m5C）。
DNA甲基化與腫瘤發(fā)生
近年來的大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞癌變有著密切的聯(lián)系，主要原因在以下幾個(gè)方面：1.甲基化的CpG島二核苷酸中的胞嘧啶以較高的頻率脫氨基變成胸腺嘧啶，造成基因突變；2.抑癌基因和DNA修復(fù)基因由于超甲基化而沉默；3.癌基因甲基化水平降低而活化；4.基因組總體甲基化水平降低使轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列活化導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降。
因此甲基化可以作為腫瘤等早期診斷的生物標(biāo)記物和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，對(duì)腫瘤的篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測(cè)都具有重要的意義。
DNA甲基化在腫瘤診斷中的應(yīng)用
早篩早診
由于細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的甲基化現(xiàn)象早于明顯的惡性表型出現(xiàn)，甲基化研究可以用于腫瘤的早期診斷。與傳統(tǒng)診斷方法相比，甲基化檢測(cè)具有早期、無創(chuàng)、快捷、靈敏度高等特點(diǎn)。
預(yù)后判定
甲基化改變與傳統(tǒng)的預(yù)后指標(biāo)之間存在密切聯(lián)系，主要包括以下四個(gè)方面：1．甲基化改變與腫瘤分級(jí)、分期有明顯的相關(guān)性。2．DNA異常甲基化可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。3．甲基化可作為腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。4．甲基化影響生存期。
分子分型
在一個(gè)癌細(xì)胞中，可有多種基因同時(shí)被異常甲基化，每種腫瘤都有其自身一套異常甲基化基因，且某些基因異常甲基化具有腫瘤特異性。因此甲基化檢測(cè)可用于腫瘤的分子分型。
DNA甲基化檢測(cè)方法
隨著DNA甲基化研究的不斷深入，其檢測(cè)方法也層出不窮。這些方法針對(duì)不同研究目的，運(yùn)用不同處理方法，幾乎涵蓋了從基因到基因組各個(gè)層次水平的研究。
根據(jù)研究水平，這些方法大致可歸為三大類：
基因組甲基化水平分析
如高效液相色譜法（HPLC）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）。
候選基因甲基化分析
如甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法（MSRE-PCR/Southern）、重亞硫酸鹽測(cè)序法（Bisulfite Sequencing）、甲基化熒光PCR法(MethyLight)、甲基化特異性PCR（MS-PCR）、焦磷酸測(cè)序等。
基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜分析
如限制性標(biāo)記基因組掃描（RLGS）、甲基化CpG島擴(kuò)增（MCA）、差異甲基化雜交（DMH）等。
我國甲基化檢測(cè)試劑盒獲證情況
近幾年，基于DNA甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)試劑盒陸續(xù)獲批面世。NMPA批準(zhǔn)的甲基化檢測(cè)試劑盒均為熒光PCR法，主要原因在于熒光PCR法操作簡(jiǎn)便，無需在PCR后電泳，且具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
根據(jù)NMPA數(shù)據(jù)顯示，目前甲基化檢測(cè)試劑獲得國家藥監(jiān)局注冊(cè)證的國內(nèi)企業(yè)有蘇州為真、上海透景、博爾誠、廈門艾德、基因科技、杭州諾輝健康以及廣州康立明等7家企業(yè)；甲基化檢測(cè)種類涉及septin9、SHOX2、RASSF1A、RNF180、SDC2、MGMT、BMP3、NDRG4等；涉及的檢測(cè)項(xiàng)目包括胃癌、結(jié)直腸癌、大腸癌、膠質(zhì)瘤等。
表. NMPA批準(zhǔn)的甲基化檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品名稱 | 生產(chǎn)廠家 | 注冊(cè)證號(hào) |
人septin9基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法） | 蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司 | 國械注準(zhǔn)20183400103 |
人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA檢測(cè)試劑盒（PCR熒光法） | 上海透景生命科技股份有限公司 | 國械注準(zhǔn)20173403354 |
RNF180/Septin9基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針法） | 博爾誠（北京）科技有限公司 | 國械注準(zhǔn)20203400447 |
人類SDC2基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法） | 廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司 | 國械注準(zhǔn)20213400007 |
septin9基因甲基化檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針法） | 博爾誠（北京）科技有限公司 | 國械注準(zhǔn)20153401481 |
人類MGMT基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法） | 基因科技（上海）股份有限公司 | 國械注準(zhǔn)20193400101 |
人類SDC2基因甲基化檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法） | 廣州市康立明生命科技有限責(zé)任公司 | 國械注準(zhǔn)20183400506 |
人septin9基因甲基化DNA檢測(cè)試劑盒（PCR熒光法） | 上海透景生命科技股份有限公司 | 國械注準(zhǔn)20193400316 |
KRAS基因突變及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隱血聯(lián)合檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針法-膠體金法） | 杭州諾輝健康科技有限公司 | 國械注準(zhǔn)20203400845 |
產(chǎn)品推薦
翌圣生物長(zhǎng)期專注于分子酶產(chǎn)品的創(chuàng)新研發(fā)，對(duì)于DNA甲基化檢測(cè)，翌圣生物可提供高靈敏、高特異的qPCR相關(guān)產(chǎn)品及NGS建庫試劑。此外，翌圣生物還可提供個(gè)性化定制服務(wù)。
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