ADCC檢測用效應(yīng)細胞株，助力藥物開發(fā)
單克隆抗體 (Monoclonal antibodies，mAb) 是由B細胞產(chǎn)生并特異性靶向抗原的物質(zhì)。1975年K?hler和Milstein利用雜交瘤技術(shù)使得大量獲取純mAb成為可能，這項技術(shù)極大地增強了抗體的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用潛力，也極大地促進mAb向臨床應(yīng)用的進展[1]。因這項創(chuàng)舉性工作，二人與英裔丹麥籍免疫學研究者Niels Kaj Jerne共同獲得了1984年的諾貝爾生理學/醫(yī)學獎。
應(yīng)用于臨床的抗體藥物（嵌合單抗、人源化單抗、全人源單抗、ADC、雙特異性抗體、小型化抗體和融合蛋白等）具有特異性、多樣性及制備定向性等特點。特異性主要體現(xiàn)在抗體能特異性結(jié)合相關(guān)抗原并選擇性殺傷腫瘤靶細胞、在動物體內(nèi)靶向性分布、對特定腫瘤療效更佳，臨床療效確切；多樣性表現(xiàn)為靶抗原多樣性、抗體結(jié)構(gòu)及活性多樣性、免疫偶聯(lián)物與融合蛋白多樣性；此外，抗體藥物也可根據(jù)需要制備具有不同治療作用的抗體。圖2.自1975 年開始治療性抗體及其應(yīng)用發(fā)展時間軸[2]
在抗體藥物開發(fā)過程中需要對所獲得的抗體進行檢測、評定抗體或靶細胞的功效，應(yīng)用的方法主要是抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）。以ADCC作用機制為原理檢測抗體是否具有ADCC生物學活性，并進一步分析抗體ADCC生物學活性的強弱已成為抗體藥物研發(fā)及其質(zhì)量控制過程中至關(guān)重要的一步。ADCC報告基因生物活性檢測試劑盒應(yīng)用生物發(fā)光法，通過測量NFAT（Nuclear factor of activated T-cells）信號通路的活化，定量檢測治療性抗體Fc效應(yīng)因子功能，來評定抗體或靶細胞的功效（圖3），當IgG抗體通過Fab段與靶細胞（病毒感染的細胞及腫瘤細胞）表面抗原決定簇特異性結(jié)合后，其Fc段可與有FcγR的殺傷細胞（NK細胞、單核-巨噬細胞、中性粒細胞）等效應(yīng)細胞結(jié)合，觸發(fā)效應(yīng)細胞的殺傷活性，直接殺傷靶細胞（病毒感染的細胞及腫瘤細胞）。在ADCC檢測過程中，效應(yīng)細胞起到關(guān)鍵的作用，能表達Fcγ RIIIa受體并依賴于抗體介導殺傷細胞，對相應(yīng)的靶細胞進行殺傷作用。翌圣生物提供的效應(yīng)細胞是經(jīng)改造后的NFAT-Luc-FcγRIIIa Jurkat穩(wěn)定細胞株，可由CD20抗體，B細胞淋巴瘤細胞（Raji、PBMC、WIL2-S細胞系等）作為靶細胞來建立ADCC生物學活性檢測方法。YEASEN開發(fā)的Jurkat效應(yīng)細胞株無菌、無支原體污染，細胞株為單克隆細胞株。◆ 機理明確：基于 ADCC 作用機制和NFAT信號通路研發(fā)；
◆ 穩(wěn)定性好：單克隆細胞株，細胞變異性低，結(jié)果準確度高；
◆ 操作簡便：效應(yīng)細胞Jurkat培養(yǎng)簡單，實驗程序操作簡便；
◆ 信號穩(wěn)定：信號值高，靈敏好，且背景低；
◆ 應(yīng)用廣泛：抗體篩選、ADCC 作用機制研究、抗體藥物的Fc功能學研究和產(chǎn)品質(zhì)控等。
采用TECAN Spark 酶標儀檢測，設(shè)置Luminescence，360-700 nm，檢測時間為10000 m sec；settle time：1 sec；使用3 µg/mL母液抗體濃度，按2.5倍稀釋13個梯度；抗體為：Rituximab, E:T=6:1。圖4.檢測值比較明顯值在(log -10至-6的區(qū)間內(nèi))
采用TECAN Spark 酶標儀檢測，設(shè)置Luminescence，360-700 nm，檢測時間為10000 m sec；settle time：1 sec；圖5&圖6：1 µg/mL抗體母液濃度起始濃度，按3倍稀釋9個梯度；抗體為：Rituximab，固定E：75000cells/孔。效靶比在(0.5~2)：1時，檢測信號值均比較接近[1] Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975;256:495–497. doi: 10.1038/256495a0. [2] Lu, RM., Hwang, YC., Liu, IJ. et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci 27, 1 (2020).
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