ADCC檢測(cè)用效應(yīng)細(xì)胞株，助力藥物開(kāi)發(fā)
單克隆抗體 (Monoclonal antibodies，mAb) 是由B細(xì)胞產(chǎn)生并特異性靶向抗原的物質(zhì)。1975年K?hler和Milstein利用雜交瘤技術(shù)使得大量獲取純mAb成為可能，這項(xiàng)技術(shù)極大地增強(qiáng)了抗體的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用潛力，也極大地促進(jìn)mAb向臨床應(yīng)用的進(jìn)展[1]。因這項(xiàng)創(chuàng)舉性工作，二人與英裔丹麥籍免疫學(xué)研究者Niels Kaj Jerne共同獲得了1984年的諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
圖1.生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)圖自諾貝爾獎(jiǎng)
應(yīng)用于臨床的抗體藥物（嵌合單抗、人源化單抗、全人源單抗、ADC、雙特異性抗體、小型化抗體和融合蛋白等）具有特異性、多樣性及制備定向性等特點(diǎn)。特異性主要體現(xiàn)在抗體能特異性結(jié)合相關(guān)抗原并選擇性殺傷腫瘤靶細(xì)胞、在動(dòng)物體內(nèi)靶向性分布、對(duì)特定腫瘤療效更佳，臨床療效確切；多樣性表現(xiàn)為靶抗原多樣性、抗體結(jié)構(gòu)及活性多樣性、免疫偶聯(lián)物與融合蛋白多樣性；此外，抗體藥物也可根據(jù)需要制備具有不同治療作用的抗體。
圖2.自1975 年開(kāi)始治療性抗體及其應(yīng)用發(fā)展時(shí)間軸[2]
在抗體藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中需要對(duì)所獲得的抗體進(jìn)行檢測(cè)、評(píng)定抗體或靶細(xì)胞的功效，應(yīng)用的方法主要是抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）。以ADCC作用機(jī)制為原理檢測(cè)抗體是否具有ADCC生物學(xué)活性，并進(jìn)一步分析抗體ADCC生物學(xué)活性的強(qiáng)弱已成為抗體藥物研發(fā)及其質(zhì)量控制過(guò)程中至關(guān)重要的一步。ADCC報(bào)告基因生物活性檢測(cè)試劑盒應(yīng)用生物發(fā)光法，通過(guò)測(cè)量NFAT（Nuclear factor of activated T-cells）信號(hào)通路的活化，定量檢測(cè)治療性抗體Fc效應(yīng)因子功能，來(lái)評(píng)定抗體或靶細(xì)胞的功效（圖3），當(dāng)IgG抗體通過(guò)Fab段與靶細(xì)胞（病毒感染的細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞）表面抗原決定簇特異性結(jié)合后，其Fc段可與有FcγR的殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）等效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，觸發(fā)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性，直接殺傷靶細(xì)胞（病毒感染的細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞）。
圖3.抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用在ADCC檢測(cè)過(guò)程中，效應(yīng)細(xì)胞起到關(guān)鍵的作用，能表達(dá)Fcγ RIIIa受體并依賴于抗體介導(dǎo)殺傷細(xì)胞，對(duì)相應(yīng)的靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷作用。翌圣生物提供的效應(yīng)細(xì)胞是經(jīng)改造后的NFAT-Luc-FcγRIIIa Jurkat穩(wěn)定細(xì)胞株，可由CD20抗體，B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞（Raji、PBMC、WIL2-S細(xì)胞系等）作為靶細(xì)胞來(lái)建立ADCC生物學(xué)活性檢測(cè)方法。YEASEN開(kāi)發(fā)的Jurkat效應(yīng)細(xì)胞株無(wú)菌、無(wú)支原體污染，細(xì)胞株為單克隆細(xì)胞株。◆ 機(jī)理明確：基于 ADCC 作用機(jī)制和NFAT信號(hào)通路研發(fā)；
◆ 穩(wěn)定性好：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞株，細(xì)胞變異性低，結(jié)果準(zhǔn)確度高；
◆ 操作簡(jiǎn)便：效應(yīng)細(xì)胞Jurkat培養(yǎng)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)程序操作簡(jiǎn)便；
◆ 信號(hào)穩(wěn)定：信號(hào)值高，靈敏好，且背景低；
◆ 應(yīng)用廣泛：抗體篩選、ADCC 作用機(jī)制研究、抗體藥物的Fc功能學(xué)研究和產(chǎn)品質(zhì)控等。
采用TECAN Spark 酶標(biāo)儀檢測(cè)，設(shè)置Luminescence，360-700 nm，檢測(cè)時(shí)間為10000 m sec；settle time：1 sec；使用3 µg/mL母液抗體濃度，按2.5倍稀釋13個(gè)梯度；抗體為：Rituximab, E:T=6:1。圖4.檢測(cè)值比較明顯值在(log -10至-6的區(qū)間內(nèi))
采用TECAN Spark 酶標(biāo)儀檢測(cè)，設(shè)置Luminescence，360-700 nm，檢測(cè)時(shí)間為10000 m sec；settle time：1 sec；圖5&圖6：1 µg/mL抗體母液濃度起始濃度，按3倍稀釋9個(gè)梯度；抗體為：Rituximab，固定E：75000cells/孔。效靶比（E:T在2：1~1：1）檢測(cè)信號(hào)值最高，效靶比在(0.5~2)：1時(shí)，檢測(cè)信號(hào)值均比較接近[1] Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975;256:495–497. doi: 10.1038/256495a0. [2] Lu, RM., Hwang, YC., Liu, IJ. et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci 27, 1 (2020).
初級(jí)會(huì)員·13年
