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重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是Piepenburg等人在2006年利用參與細(xì)胞DNA合成的蛋白重組和修復(fù)開發(fā)出的一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)可以在37~42 ℃條件下實(shí)現(xiàn)待測(cè)靶標(biāo)的快速檢測(cè)。它具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)儀器依賴程度低且可整合多種檢測(cè)模式等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[1]。
RPA技術(shù)主要依賴于能結(jié)合寡核苷酸引物的T4噬菌體來(lái)源的重組酶T4 UvsX、單鏈結(jié)合蛋白gp32和鏈置換Bsu DNA 聚合酶以及兩條特異性的上下游引物實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，具體擴(kuò)增原理如圖1所示：
圖1.重組酶聚合酶擴(kuò)增RPA技術(shù)擴(kuò)增原理圖[2]
1.重組酶引物復(fù)合體的形成：重組酶T4 UvsX在ATP的參與和定位因子（T4 UvsY）的幫助下與擴(kuò)增引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，并在雙鏈DNA中尋找同源序列；
2.重組酶引物復(fù)合體定位至同源序列：重組酶引物復(fù)合體一旦定位到同源序列，則會(huì)插入雙鏈DNA形成D-環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，單鏈結(jié)合蛋白gp32會(huì)與解開的DNA鏈結(jié)合防止進(jìn)一步被置換。
3.鏈置換擴(kuò)增啟動(dòng)：重組酶T4 UvsX從重組酶引物復(fù)合體中被水解，3'端引物暴露并與Bsu DNA聚合酶結(jié)合，DNA開始復(fù)制延伸，最終兩條母鏈分離，形成兩條新的互補(bǔ)雙鏈DNA。該反應(yīng)在37-42℃下進(jìn)行，可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列1012倍的擴(kuò)增。
圖2.RPA技術(shù)應(yīng)用
| 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品作用 |
| Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL) | 11078ES | 結(jié)合引物與原始靶核酸序列互補(bǔ)合成新的DNA模板 |
| T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL) | 11079ES | 具有配對(duì)和鏈轉(zhuǎn)移活性的重組酶 |
| T4 UvsY protein (2 μg/μL) | 11080ES | 重組酶輔助因子，刺激T4 UvsX的單鏈DNA依賴性ATP酶活性并降低活性所需的T4 UvsX臨界濃度 |
| T4 gene 32 protein (gp 32) T4噬菌體基因32編碼蛋白 | 11081ES | 參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組與解鏈后的單鏈DNA結(jié)合，防止自雜交 |
| Creatine Kinase (2 μg/μL) 肌酸激酶 | 14502ES | 刺激ATP和肌酸分解為磷酸肌酸和ADP，釋放能量 |
| Exonuclease III (100 U/μL) | 14525ES | 具有3’→5’外切酶活性，切斷熒光探針中淬滅基團(tuán)，釋放熒光 |
客戶采用翌圣Bsu DNA polymerase (Large fragment, 5 U/μL)、T4 UvsX Recombinase (2 μg/μL)、T4 UvsY protein (2 μg/μL)、T4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶Creatine Kinase (2 μg/μL) 進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，得到正確的目的條帶，且條帶清晰、明亮，結(jié)果表明，PRA技術(shù)核心酶原料可實(shí)現(xiàn)高效RPA等溫?cái)U(kuò)增。
圖3 客戶測(cè)試翌圣重組酶聚合酶核心酶原料擴(kuò)增結(jié)果圖
注：2、4為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組；1、3為陰性對(duì)照組
參考文獻(xiàn)
[1] Zhao Y, Chen F, Li Q, Wang L, Fan C. Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chem Rev. 2015 Nov 25;115(22):12491-545. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00428. Epub 2015 Nov 9. PMID: 26551336.
[2] 王亞楠, 陳昌國(guó). 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 46(5):8.
