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漲知識(shí) | 克隆專(zhuān)題二:不同分子克隆方法介紹(下)

2023-10-20  閱讀(694)

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漲知識(shí) | 克隆專(zhuān)題二:不同分子克隆方法介紹(下)

 


克隆是英文“clone"或“cloning"的音譯,而英文“clone"則起源于希臘文“Klone",原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年J.B.S.Haldane在題為“人類(lèi)種族在未來(lái)二萬(wàn)年的生物可能性"的演講上采用“克?。–lone)"的術(shù)語(yǔ),把“克隆技術(shù)"帶到了人們的視野中。

 

克隆技術(shù)又稱(chēng)為“生物放大技術(shù)",目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆",又稱(chēng)重組DNA技術(shù),即通過(guò)重組技術(shù)將目的DNA片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來(lái),在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá),產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。

 

之前小翌給小伙伴們介紹了常規(guī)的分子克隆方法,接下來(lái)繼續(xù)帶領(lǐng)大家認(rèn)識(shí)一下新的、非常規(guī)的分子克隆技術(shù),包括無(wú)縫克隆中的Golden Gate技術(shù)、Gateway技術(shù)、不依賴(lài)基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法等等。

 

01
Golden Gate技術(shù)
Golden Gate克隆在2008年由Engler等人提出,是依賴(lài)IIS型限制酶的無(wú)縫克隆技術(shù),能媲美Gibson Assembly,主要用于多片段克隆組裝。實(shí)驗(yàn)步驟與傳統(tǒng)克隆技術(shù)相似,但限制性?xún)?nèi)切酶酶切原理不同。傳統(tǒng)酶切使用的TypeII型限制性?xún)?nèi)切酶通常識(shí)別4-8 bp的回文序列,并在識(shí)別序列內(nèi)部切割產(chǎn)生粘性末端或平末端。

Golden Gate克隆技術(shù)通過(guò)TypeIIS型限制性?xún)?nèi)切酶(翌圣BsmBI Cat#15203ES、BspQI限制性?xún)?nèi)切酶Cat#15202ES、FuniCut™ BsaI Cat#15005ES)識(shí)別目的序列以外的四個(gè)堿基,剪切后獲得粘性末端,直接用于目的片段的連接。通過(guò)連接酶(翌圣T4 DNA連接酶Cat#10300)連接形成重組質(zhì)粒,使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中,由于限制性?xún)?nèi)切酶的特性,酶切連接后酶切位點(diǎn)不再存在,能達(dá)到精確的無(wú)縫克隆。Engler等人利用該技術(shù)成功連接了9個(gè)目的片段,連接率達(dá)90%以上。

圖1. Golden Gate Assembly克隆原理示意圖【1】

 

02
Gateway技術(shù)
Gateway技術(shù)最早在1990s年被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用,主要用于表達(dá)載體、RNAi干擾載體等載體的構(gòu)建。其原理利用噬菌體的特性:即噬菌體DNA會(huì)定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上??茖W(xué)家們研究發(fā)現(xiàn),噬菌體和細(xì)菌內(nèi)均含有重組位點(diǎn)attP和attB,能有效幫助噬菌體入侵宿主細(xì)胞,從而將噬菌體DNA插入到細(xì)菌基因組上,同時(shí)在重組位點(diǎn)上產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn):attL和attR,該過(guò)程可逆。

 

Gateway構(gòu)建表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)流程如下圖:

 

圖2. Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體【2】

 

此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于利用位點(diǎn)特異重組成入門(mén)載體后,不再受到酶切位點(diǎn)和連接酶的限制,可以多次轉(zhuǎn)移到其他載體上。再加上供體載體含有ccdB致死基因,會(huì)殺死重組不成功的質(zhì)粒,所以陽(yáng)性克隆率高,但受控于存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。此外,需要注意的一點(diǎn)是,進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)需要使用對(duì)CcdB敏感的大腸桿菌菌株,如翌圣DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Cat#11802ES)、翌圣化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Cat#11801ES),能抑制大腸桿菌菌株的生長(zhǎng)繁殖,進(jìn)行負(fù)篩。

 

03
不依賴(lài)基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法(SLIC)
2007年,來(lái)自于哈佛醫(yī)學(xué)院的Li等人建立了不依賴(lài)序列和連接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning,SLIC)。SLIC方法不受目的序列和連接反應(yīng)的限制,能將任意、多個(gè)DNA片段組裝起來(lái),在體外完成重組反應(yīng),用途非常廣泛。

 

基本操作流程如下:

 
01
 
PCR擴(kuò)增目的片段,在片段兩端分別加上15-30 bp的同源序列;
02
 
利用T4 DNA聚合酶的3'-5'外切酶活性,在22℃條件下消化DNA片段,產(chǎn)生含有同源序列的5'-ssDNA突出端。突出端長(zhǎng)度可通過(guò)dCTP控制;
03
 
將處理后的目的片段置于T4 DNA連接緩沖液中,于37℃完成突出單鏈的復(fù)性重組,形成含有缺口的環(huán)狀中間體,直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞;
04
 
利用大腸桿菌自身的修復(fù)系統(tǒng)使其形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。

 

圖3. SLIC法構(gòu)建表達(dá)載體的步驟【3】

 

04
細(xì)胞裂解物體外無(wú)痕連接
細(xì)胞裂解物體外無(wú)痕連接(SLiCE)是利用細(xì)胞裂解物而進(jìn)行體外無(wú)痕組裝DNA的方法,能一步組裝多個(gè)目的片段。它在2012年由Zhang等人提出,在2013年由Fisher等人進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn),擴(kuò)增了可用于該技術(shù)的細(xì)胞裂解物,此外,Itaya等人發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌本身就具有可用于片段組裝的同源重組系統(tǒng),進(jìn)一步擴(kuò)展了可用的細(xì)胞裂解物來(lái)源。相比于其他不依賴(lài)限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶的技術(shù),SLiCE方法使用的細(xì)胞裂解物更易獲得和保存,實(shí)驗(yàn)成本更低,適用于大多數(shù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。

其具體的操作步驟是,利用PCR技術(shù)在目的片段兩側(cè)分別加上20-25 bp的同源序列,用DpnI酶(翌圣FuniCut™ DpnI Cat#15052ES)消化處理,組裝片段按合適的比例混勻,加入大腸桿菌細(xì)胞裂解物,37℃反應(yīng)1 h,然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,即可實(shí)現(xiàn)體外無(wú)痕組裝DNA。

 

圖4. SLiCE技術(shù)【4】

 

通過(guò)上述兩篇專(zhuān)題,小翌介紹了一些傳統(tǒng)的、應(yīng)用范圍廣的、新型的分子克隆方法,希望對(duì)各位科研er們的日常實(shí)驗(yàn)有所幫助和啟發(fā)。隨著近幾年基因編輯技術(shù)、合成生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,分子克隆技術(shù)越來(lái)越趨于高效化、多樣化,其中的每一項(xiàng)內(nèi)容都值得我們?nèi)ヌ骄?。關(guān)注我們,小翌會(huì)在下一期的分子克隆技術(shù)專(zhuān)題中給大家具體講解分子克隆技術(shù)中應(yīng)用到那些技術(shù),為您的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)新的思路與方向,期待下一次的見(jiàn)面~

 

05
相關(guān)產(chǎn)品列表

 

產(chǎn)品定位

產(chǎn)品名稱(chēng)

產(chǎn)品貨號(hào)

規(guī)格

Golden Gate組裝

BspQI限制性?xún)?nèi)切酶 (10 U/μL)

15202ES76

500 U

Golden Gate組裝

BsmBI(10 U/μL)

15203ES80

1000 U

通用緩沖液,5min完成精準(zhǔn)酶切

FuniCut™快速限制性?xún)?nèi)切酶

15001ES-15051ES

50 T

T4連接

Hieff® Gold T4 DNA Ligase

10300ES80

1000 U

5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化

F DH5α化學(xué)感受態(tài)

11803ES80

10×100 μL

常規(guī)化學(xué)感受態(tài)

DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

11802ES80

10×100 μL

常規(guī)化學(xué)感受態(tài)

化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

11801ES80

10×100 μL

常規(guī)PCR

2×Hieff® PCR Master Mix(With Dye)

10102ES03/08

1 mL/5×1 mL

常規(guī)PCR,不含染料

2×Hieff® PCR Master Mix(No Dye)

10103ES03/08

1 mL/5×1 mL

快速PCR,快至1s/kb

2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye)

10157ES03/08

1 mL/5×1 mL

 

 

06
參考文獻(xiàn)
1.Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, et al. Golden Gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIS restriction enzymes. PLoS ONE, 2009, 4(5): E5553.
2.林春晶, 韋正乙, 蔡勤安等. 幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物技術(shù), 2008(05): 84-87.
3.張陽(yáng)璞, 楊淑慎. 幾種新型植物基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[J].生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(03): 311-327.
4.楊發(fā)譽(yù), 楊云彭, 霍毅欣. 合成生物學(xué)中不依賴(lài)限制性?xún)?nèi)切酶的分子克隆策略[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2018, 34(04): 364-370.



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