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產品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100 T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 11139ES60 | 應用領域 | 生物產業(yè) |
產品介紹
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11139ES60 | 100 T | 1303.00 |
產品描述
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步驟的cDNA第—鏈合成試劑盒。該試劑盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而開發(fā)。該酶cDNA合成速度快，且熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達60℃的反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄。同時，該酶增強了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉錄。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可合成長達19.8 kb的cDNA。
該試劑盒包含gDNA Digester Mix，可去除RNA模板中殘留的基因組DNA污染，保證后續(xù)結果更加可靠。該試劑盒提供兩種cDNA合成引物：Random Primers N6和oligo (dT)18，用戶可根據(jù)需要，選擇Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作為逆轉錄引物，合成的單鏈cDNA產物可直接用來進行后續(xù)PCR或者qPCR反應。
產品組分
編號 | 組分 | 11139ES60 (100 T) |
11139-A | RNase-free ddH2O | 1 mL×2 |
11139-B | 5×gDNA Digester Mix | 300 μL |
11139-C | 10×Hifair® III Super Buffer1 | 200 μL |
11139-D | Hifair® III RT Enzyme Mix2 | 100 μL |
11139-E | Random Primers N6 (50 μM ) | 100 μL |
11139-F | Oligo (dT)18 (50 μM) | 100 μL |
【注】：1) 10×Hifair® III Super Buffer 包含gDNA digester抑制劑和dNTPs。
2) Hifair® III RT Enzyme Mix 包含RNase inhibitor。
運輸與保存
冰袋運輸。-20℃保存，有效期18個月。
注意事項
1）反應液的配制應在冰上操作完成，操作過程應避免RNase污染。
2）建議RNA是溶于水而不是TE中，因為TE會干擾gDNA去除以及逆轉錄反應。
3）5×gDNA Digester Mix、10×Hifair® III Super Buffer、Hifair® III RT Enzyme Mix使用前請輕輕上下顛倒混勻，并小心離心至底部。吸取液體時請使用量程合適的移液器，槍頭不要插入液面下過深。
4）qPCR實驗推薦基因組去除步驟，保證結果更加真實可靠。
關于逆轉錄引物的選擇
1） 如果模板為真核生物來源，建議選擇Oligo (dT)18 ，與真核生物mRNA的3’ Poly A尾配對，可獲得///高產量的全長cDNA。
2）原核生物RNA的反轉錄請選用Random Primers N6或者基因特異性引物。
3）Random Primers N6適用性較廣，適用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
第—鏈cDNA合成操作步驟
一、若實驗需要去除殘留基因組DNA
1. gDNA消化
在RNase-free離心管中配制如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。42℃孵育2 min。
組分 | 使用量 |
RNase-free ddH2O | To 15 μL |
5×gDNA Digester Mix | 3 μL |
Total RNA | 10 pg -5 μg* |
or mRNA | 10 pg-500 ng* |
【注】：* 若后續(xù)實驗為qPCR，Total RNA投入量為10 pg -1 μg；mRNA的投入量為10 pg-100 ng。若基因的表達豐度很低，多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。
2. 逆轉錄反應體系配制（20 μL體系）
組分 | 使用量（μL） |
上一步的反應液 | 15 |
10×Hifair® III Super Buffer | 2 |
Hifair® III RT Enzyme Mix | 1 |
Random Primers N6 (50 μM) | 1 |
or Oligo (dT)18 (50 μM) | or 1 |
or Gene Specific Primer (2 μM) | or 1 |
RNase-free ddH2O | to 20 |
【注】：1）逆轉錄引物：后續(xù)進行qPCR時，推薦Random Primers N6與Oligo (dT)18 1:1混合使用。
2）建議先加入10×Hifair® III Super Buffer混勻后再添加逆轉錄引物，以保證*抑制gDNA Digester的活性。
3）體系配制完成后，請用移液器輕輕吹打混勻。
3. 逆轉錄程序設置
溫度 | 時間 |
25℃ | 5 min |
55℃1 | 15 min2 |
85℃ | 5 min |
【注】：1）逆轉錄溫度：推薦使用55℃。對于高GC含量模板或者復雜模板，可將逆轉錄溫度提高到60℃。
2）逆轉錄時間：后續(xù)進行qPCR時，推薦15 min；若后續(xù)用于PCR時，推薦30 min-60 min。
4. 逆轉錄產物可以-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，-80℃保存，避免反復凍融。
二、若實驗無需去除基因組DNA
1. RNA模板變性
在RNase-free離心管中配制如下混合液，用移液器輕輕吹打混勻。65℃孵育5 min，迅速置于冰上，并靜置3 min。
組分 | 使用量 |
RNase-free ddH2O | To 17 μL |
Total RNA | 10 pg -5 μg |
or mRNA | 10 pg-500 ng |
Random Primers N6 (50 μM) | 1 μL |
or Oligo (dT)18 (50 μM) | 1 μL |
or Gene Specific Primer (2 μM) | or 1 μL |
2. 逆轉錄反應體系配制（20 μL體系）
組分 | 使用量 |
上一步的反應液 | 17 μL |
10×Hifair® III Super Buffer | 2 μL |
Hifair® III RT Enzyme Mix | 1 μL |
【注】：體系配制完成后，請用移液器輕輕吹打混勻。
3. 參照上述程序進行后續(xù)上機實驗。
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